通过调节吲哚青绿在交联聚离子复合物纳米颗粒中的分子和超分子形式来控制光疗模式

《Materials Today Advances》：Phototherapy mode control by tuning molecular and supramolecular forms of indocyanine green in crosslinked polyion complex nanoparticles

　　

摘要：光热治疗（PTT）提供了一种治疗缺氧肿瘤的微创方法，而光动力治疗（PDT）受限于其氧依赖性。吲哚青绿（ICG）是一种经临床批准的近红外（NIR）染料，具有PTT和PDT的潜力，但其应用受到光稳定性差、清除迅速和聚集的阻碍，导致药代动力学不佳和光治疗效果有限。在此，研究人员通过结合ICG二聚化的化学转化、受控超分子组装为染料聚集体以及定制化配方策略，解决了这些限制。研究人员系统比较了三种形式：单体ICG、其共价二聚体（dICG）以及相应的J-聚集体（dIJA），每种形式均使用聚（2-乙基-2-噁唑啉）-b-聚（L-鸟氨酸）作为聚电解质载体基质，配制成聚离子复合物纳米颗粒（PNPs）。随后通过京尼平介导的核心交联，产生了具有增强稳定性、高封装效率和保留光学特性的交联纳米颗粒（CPNPs）。CPNPs始终优于游离染料和非交联PNPs，表现出改善的胶体稳定性、增强的光稳定性和更高的光热性能。在FaDu细胞中，负载ICG的CPNPs介导了氧依赖性的光动力效应，而负载dICG和dIJA的CPNPs在NIR照射下诱导了氧非依赖性的光热细胞毒性。研究人员的综合比较表明，控制ICG衍生物的分子形式和超分子组装可实现可调的NIR光疗，将基于dICG和dIJA的CPNPs确定为通过光声成像（PAI）引导的PTT治疗缺氧肿瘤的有前景平台。

**论文解读：通过调控吲哚青绿的分子与超分子形式实现光疗模式控制**

**研究背景与问题**

光活化疗法，包括光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），作为微创癌症治疗策略备受关注。PDT依赖氧气产生细胞毒性活性氧（ROS），而PTT通过光热剂（PTA）将光能转化为热，具有氧非依赖性，尤其适用于治疗缺氧肿瘤。吲哚青绿（ICG）是一种已获临床批准的近红外（NIR）染料，兼具PDT和PTT潜力，但其应用受限于光稳定性差、体内清除迅速、易聚集以及ROS产生效率低等问题。此外，ICG的聚集行为（如J-聚集体的形成）可增强光热转换效率（PCE），但稳定性不足。其共价二聚体（dICG）通过结构修饰可提高PCE，但同样面临聚集控制和生物分布挑战。因此，亟需一种能同时稳定不同ICG形式并实现光疗模式调控的纳米递送平台。

**研究内容与结论**

本研究通过合成dICG并利用聚（2-乙基-2-噁唑啉）-b-聚（L-鸟氨酸）（PEtOx-PLO）嵌段共聚物，采用静电自组装和京尼平交联策略，成功制备了负载ICG、dICG及其J-聚集体（dIJA）的交联聚离子复合物纳米颗粒（CPNPs）。研究系统比较了三种形式在胶体稳定性、光学特性、光热光声性能及体外光毒性方面的差异。结果表明，dICG和dIJA负载的CPNPs展现出优异的稳定性、高光热转换效率和光声信号，且机制上以光热效应为主，而ICG-CPNPs主要依赖氧依赖的光动力效应。该研究发表于《Materials Today Advances》，为根据肿瘤微环境选择合适的光疗模式提供了新策略。

**关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）通过ICG在65°C水溶液中二聚化合成dICG，并经尺寸排阻色谱纯化；2）利用PEtOx-PLO嵌段共聚物（通过N-羧基环内酸酐开环聚合合成）与负电荷染料静电自组装形成非交联聚离子复合物纳米颗粒（PNPs）；3）使用京尼平（genipin）对PLO核心进行交联，制得CPNPs；4）通过动态光散射（DLS）、紫外-可见-近红外（UV-Vis-NIR）光谱、光热升温实验及光声成像（PAI）系统表征CPNPs的理化性质；5）在FaDu人咽鳞癌细胞系（购自ATCC）中进行细胞摄取和光毒性实验，并通过4°C抑制实验和乏氧条件实验区分PDT与PTT机制。

**研究结果**

**Synthesis and preparation of dICG and dIJA**：研究人员通过ICG在65°C水溶液中二聚化24小时合成dICG，纯化后经HPLC、质谱和NMR确认结构纯度>95%。dICG在水溶液中可自组装为dIJA，其特征吸收峰位于890 nm。

**Synthesis of PEtOx-PLO block copolymers**：通过PEtOx大分子引发剂引发N_δ-三氟乙酰-L-鸟氨酸NCA开环聚合，再经碱性脱保护，获得PEtOx₁₂₀-PLO₆₀嵌段共聚物，经SEC和1H NMR确认结构。

**Preparation of crosslinked polymeric nanoparticles (CPNPs)**：将ICG、dICG或dIJA水溶液与PEtOx-PLO在HEPES缓冲液中混合，经静电作用形成PNPs，再添加京尼平交联过夜，得到CPNPs。ICG-CPNPs和dICG-CPNPs的水力学直径分别为178 nm和192 nm，dIJA-CPNPs为101 nm，ζ电位接近0 mV。UV-Vis-NIR光谱显示，ICG在CPNPs中以H-聚集体为主，dICG形成未定义dIJA，而dIJA-CPNPs保留了886 nm的窄吸收峰。

**Stability studies**：CPNPs在水及4°C储存180天后尺寸和吸收谱变化小于20%，且ICG未转化为dICG或dIJA。在NaCl浓度高达500 mM时仍保持稳定。在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，ICG-CPNPs出现快速染料释放（与蛋白结合有关），而dICG-CPNPs和dIJA-CPNPs在24小时内保持稳定，交联显著增强了dICG体系的稳定性。

**Photothermal and photoacoustic properties in solution**：在808 nm激光照射（0.5 W/cm2）下，dICG-CPNPs和dIJA-CPNPs表现出更高的光热转换效率（PCE分别为95%和94%）、比吸收率（SAR分别为23.6×103 W/g和23.4×103 W/g）和循环稳定性（ΔT下降<2°C），而ICG-CPNPs的ΔT从10°C降至2°C。光声成像（PAI）显示，dICG-和dIJA-CPNPs在780 nm下的光声振幅高于ICG-CPNPs。此外，理论计算表明，在886 nm激发下，dIJA-CPNPs的ζT（光热系数）可达6.11×10? M?1 cm?1，约为808 nm时的三倍。

**Cellular uptake**：在FaDu细胞中，游离ICG的摄取量是dICG的10倍，dIJA的4倍，且ICG摄取在4°C时显著降低，提示主动内吞机制。ICG-CPNPs的摄取模式与游离ICG相似，与快速释放一致。dICG-和dIJA-CPNPs在37°C的摄取高于游离染料，但在4°C无显著差异，暗示抗洗涤吸附为主要机制。

**Photocytotoxicity studies and PDT vs PTT effects**：在808 nm激光照射下，ICG和ICG-CPNPs在180 J/cm2光剂量下即表现出强光毒性（IC₅₀约4 μg/mL），而dICG-和dIJA-CPNPs在360 J/cm2下才达到类似效果（IC₅₀分别为10.8和3.2 μg/mL）。通过4°C抑制实验（抑制热效应）和乏氧实验（去除氧）区分机制：ICG-CPNPs在4°C下光毒性未降低，但在乏氧条件下完全消失，证实为氧依赖的PDT；dICG-和dIJA-CPNPs在4°C下光毒性显著降低，但在乏氧条件下无变化，证实为氧非依赖的PTT。

**总结与讨论**

研究人员通过系统比较三种ICG衍生物（单体、二聚体、J-聚集体）在交联纳米颗粒中的光疗性能，揭示了分子形式和超分子组装对光疗模式的调控作用。dICG和dIJA负载的CPNPs具有优异的稳定性和光热性能，其光毒性机制以PTT为主，适用于缺氧肿瘤治疗；而ICG-CPNPs则主要依赖PDT，受氧浓度限制。该研究为设计可调光疗平台提供了新思路，并为未来动物实验和临床转化奠定了基础。

**研究结论**：通过合成的dICG和PEtOx-PLO嵌段共聚物及京尼平交联策略，成功制备了负载ICG、dICG或dIJA的交联聚合物纳米颗粒（CPNPs），旨在作为光声成像（PAI）引导的PTT的光诊疗剂。该配方策略有效维持了染料的原始化学结构，确保了胶体稳定性，并避免了染料在水环境中的降解。与游离染料相比，CPNPs表现出增强的光漂白抗性和优越的光热及光声响应，凸显了其作为稳健PTA的潜力。值得注意的是，ICG-CPNPs在RPMI培养基中表现出快速释放，而dICG-CPNPs和dIJA-CPNPs则显示出更持久的释放曲线，使其更适合未来的体内应用。体外研究表明，在暗条件下，游离染料和CPNPs在FaDu细胞系中均具有优异的生物相容性，而在808 nm激光照射下产生显著的光毒性效应。重要的是，机制研究表明，ICG和ICG-CPNPs的光毒性主要由氧依赖的光动力过程驱动，而dICG和dIJA负载的CPNPs则通过氧非依赖的光热机制发挥作用。总体而言，本研究开发的菁染料负载CPNPs代表了具有可调特性的多功能纳米平台，可适应不同的肿瘤微环境。特别是，基于dICG的CPNPs作为安全的生物候选物，在近红外PTT治疗缺氧肿瘤方面具有广阔前景。