FePt纳米颗粒的动脉内递送诱导铁死亡和免疫浸润以增强放疗

《Materials Today Bio》：Intra-Arterial Delivery of FePt Nanoparticles Induces Ferroptosis and Immune Infiltration to Enhance Radiotherapy

　　

纳米医学的最新进展为增强放疗和克服肿瘤放射抵抗提供了新机遇。在本研究中，研究人员探讨了通过动脉内（IA）给药递送铁铂纳米颗粒（FePt NPs）以改善肿瘤靶向性和治疗效果的潜力。FePt NPs显著抑制了三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的增殖，并增强了放射敏感性。机制研究表明，FePt NPs诱导铁死亡，其特征为脂质过氧化（LPO）、线粒体损伤和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX₄）下调，导致损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，包括三磷酸腺苷（ATP）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和钙网蛋白（CRT），从而促进铁死亡相关的免疫原性细胞死亡（ICD）。体外细胞因子阵列分析进一步揭示了与炎症反应和免疫细胞募集相关的免疫相关细胞因子的调控。体内研究表明，与传统的静脉内给药相比，IA给药显著增加了肿瘤内FePt NPs的积累，从而增强了肿瘤抑制效果。FePt NPs与放疗的联合治疗进一步促进了肿瘤微环境（TME）中T细胞和巨噬细胞的浸润，表明免疫激活增强。重要的是，在通过经动脉栓塞（TAE）接受FePt NPs治疗的比格犬肝肿瘤模型中，研究人员观察到肿瘤消退或稳定，同时伴有免疫浸润增加。这些发现表明，IA递送的FePt NPs作为铁死亡诱导的放射增敏剂，重塑了肿瘤免疫微环境，并将免疫学上的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。该方法凸显了局部纳米颗粒递送在癌症放射免疫治疗中的转化潜力。

**论文解读：FePt纳米颗粒动脉内递送诱导铁死亡与免疫浸润增强放疗的机制与转化研究**

**研究背景与问题**

放疗是实体瘤治疗的核心手段之一，但实体瘤内的严重缺氧和肿瘤放射抵抗性常限制其疗效，并可能促进肿瘤侵袭和转移。免疫治疗作为新兴策略，单独使用时对多数肿瘤类型临床应答率仍然较低。纳米医学的发展为增强放疗、克服放射抵抗提供了新途径，特别是纳米药物介导的放疗可诱导免疫原性细胞死亡（ICD），直接杀伤肿瘤细胞并激发系统性抗肿瘤免疫。ICD的特征是损伤相关分子模式（DAMPs）的胞外释放，包括表面暴露的钙网蛋白（CRT）、分泌型三磷酸腺苷（ATP）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1），这些分子被模式识别受体识别，激活树突状细胞迁移和T细胞启动。在ICD的多种机制（凋亡、坏死、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡）中，铁死亡与放疗疗效密切相关。然而，开发有效桥接这些过程以最大化临床疗效的平台仍是挑战。双金属纳米颗粒作为级联增敏放大器，可缓解缺氧并放大放疗诱导的ICD效应，具有巨大潜力。本研究假设铁铂纳米颗粒（FePt NPs）可作为强效的铁死亡诱导型放射增敏剂，不仅放大放疗诱导的DNA损伤，还能通过启动铁死亡-ICD-免疫激活级联反应激发系统性抗肿瘤免疫。

**研究目的与意义**

研究人员旨在探讨FePt NPs通过动脉内（IA）给药作为铁死亡诱导剂的治疗潜力，评估其增强放疗效果和调节肿瘤免疫微环境的能力。在鼠源和伴侣犬肿瘤模型中，与传统静脉内（IV）给药相比，IA给药是否改善FePt NPs积累、治疗效果和免疫细胞浸润，并建立铁死亡基纳米医学的转化框架。论文发表在《Materials Today Bio》。

**关键技术方法概览**

本研究采用体外细胞实验（人源TNBC细胞系MDA-MB-231和Hs578T、鼠源4T1细胞、树突状细胞系DC2.4）和体内动物模型（BALB/c小鼠皮下移植4T1肿瘤，以及自然发生肝肿瘤的伴侣犬）。主要技术包括：FePt NPs的合成与表征（透射电镜TEM、超导量子干涉仪SQUID、能谱EDX）；细胞摄取与克隆形成实验评估细胞毒性；流式细胞术检测脂质活性氧（ROS）和CRT表面暴露；蛋白质印迹检测铁死亡相关蛋白表达；免疫荧光染色观察HMGB1转位；细胞因子阵列分析分泌谱；小鼠动脉内给药模型建立；组织生物分布（电感耦合等离子体发射光谱法ICP-OES）与免疫组化（IHC）染色；犬经动脉栓塞（TAE）模型及CT影像监测。

**研究结果**

**3.1 FePt NPs增强放疗对癌细胞的杀伤作用**
通过ICP-OES定量显示，FePt NPs在4T1、Hs578T和MDA-MB-231细胞中的摄取量分别为1.76±0.48、2.04±0.49和1.04±0.14 ng/细胞。克隆形成实验表明，FePt NPs单独处理显著抑制细胞增殖，联合IR（2或4 Gy）后存活分数进一步降低，证实FePt NPs增强TNBC细胞的放射敏感性。

**3.2 FePt NPs诱导TNBC细胞铁死亡**
利用特异性抑制剂（凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、自噬抑制剂BFA、坏死性凋亡抑制剂Nec-1s、铁死亡抑制剂Fer-1）联合处理，只有Fer-1几乎完全逆转FePt NPs诱导的细胞死亡（从33.7%恢复至99.1%），表明铁死亡是主要死亡方式。蛋白质印迹显示，FePt NPs处理导致GPX₄下调、PTGS2（COX-2）上调、HO-1显著上调，以及TfR1和FTH1时间依赖性升高，进一步支持铁死亡激活。IR联合处理未显著改变铁死亡相关蛋白表达，提示IR主要诱导DNA损伤而非影响铁死亡。

**3.3 FePt NPs通过线粒体功能障碍和LPO爆发诱导铁死亡**
高分辨率TEM显示，FePt NPs处理后细胞出现膜囊泡化、线粒体缩小、嵴减少或消失。流式细胞术（C11-BODIPY染色）表明，FePt NPs联合IR显著增加LPO水平，且MDA含量随时间升高（48 h达0.206±0.006 nmol/10⁶细胞），证实铁死亡伴随的脂质过氧化积累。

**3.4 FePt NPs通过铁死亡激活触发DAMPs释放**
ATP释放检测显示，FePt NPs处理后48 h开始显著增加，72 h进一步升高，IR联合未增强该效应。共聚焦显微镜观察到HMGB1从细胞核向胞质转位，联合IR组更明显。流式细胞术显示CRT表面暴露显著上调，在4T1、Hs578T和MDA-MB-231细胞中MFI分别增至61.2、73.5和81.1，联合IR组在Hs578T中最高（MFI=91.4）。这些结果表明FePt NPs有效诱导ICD标志物释放。

**3.5 FePt NPs与IR协同触发急性炎症信号并促进树突状细胞成熟**
细胞因子阵列分析显示，FePt NPs联合IR显著上调TNF-α、TGF-β1、IL-6和MIP-3α。利用肿瘤条件培养基处理DC2.4树突状细胞，流式细胞术检测到CD80和CD86表达上调（约1.3-1.4倍），表明铁死亡诱导的分泌组促进树突状细胞成熟。

**3.6 FePt NPs在4T1荷瘤小鼠肿瘤中优先积累**
IA给药后4 h和24 h，铁染色显示IA组肿瘤内铁阳性面积分别为5.65±1.1%和2.77±0.63%，显著高于IV组（0.342±0.07%和1.18±0.16%），证实IA给药增强肿瘤靶向性。

**3.7 IA给药增强4T1荷瘤小鼠的肿瘤抑制**
IV组中，FePt NPs单独或联合IR仅实现适度的肿瘤抑制（约7倍增长）。IA组中，FePt NPs单独给药使肿瘤生长降至3.17倍，联合IR后几乎完全消退（0.47倍变化），且体重稳定，表明IA给药显著提高治疗效果。

**3.8 IA给药FePt NPs联合IR增强免疫细胞浸润**
IHC染色定量显示，IA FePt NPs联合IR组CD3⁺ T细胞（45.96%）、CD4⁺ T细胞（34.96%）和CD8⁺ T细胞（37.65%）浸润显著高于IV组，同时CD86⁺细胞（M1型巨噬细胞标志）和CD206⁺细胞（M2型巨噬细胞）也有增加，CD11c⁺树突状细胞在IA组中更突出，但总体水平下降可能反映其迁移至淋巴结。

**3.9 FePt NPs的体内系统生物安全性与组织分布**
H&E染色显示主要器官无损伤，ICP-OES表明IA给药显著降低肝、脾、肺等器官中Pt的脱靶积累，血液学和血清生化指标均无异常，证实良好的系统安全性。

**3.10 FePt NPs在犬模型中的治疗效果与安全性**
两只自然发生肝细胞癌的犬接受FePt NPs TAE治疗。Case 1（50 kg）右叶肿瘤稳定，左叶肿瘤在2.5个月后复发；Case 2（8.2 kg）左叶肿瘤从180 cm³缩小至74.25 cm³。血液指标稳定，肝酶短暂升高后恢复，符合栓塞后综合征。

**3.11 FePt NPs在犬肿瘤中介导的免疫调节与组织病理学分析**
IHC显示，Case 1中FePt NPs处理后CD3⁺ T细胞从3.72%增至40.77%，CD4⁺从18.20%增至81.10%，CD8⁺从21.65%增至46.75%，CD20⁺ B细胞从25.03%增至73.26%，CD44⁺从48.04%增至96.56%。Case 2中CD8⁺ T细胞从0.52%增至4.25%，CD20⁺ B细胞从3.11%增至12.13%，表明适应性免疫激活。

**结论与讨论**

本研究强调给药途径对FePt NPs肿瘤积累的关键影响。常规IV给药即使联合放疗仅实现有限的肿瘤抑制，而IA给药显著提高FePt NPs在肿瘤中的积累，在犬模型中实现肿瘤消退或稳定。机制上，FePt NPs通过诱导铁死亡触发DAMPs释放（ATP、HMGB1、CRT），促进ICD，增强T细胞（特别是CD8⁺细胞毒性T细胞）浸润，将免疫学“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。该过程依赖铁依赖性脂质过氧化而非caspase介导的凋亡，为增敏放疗提供新途径。在鼠和犬大动物模型中的验证，表明IA递送的FePt NPs作为双功能放射增敏剂和免疫激活剂具有显著的临床转化潜力。