《Matrix Biology Plus》：Cyclic stretch increases transglutaminase 2-mediated Serotonylation of extracellular fibronectin in cultured optic nerve head astrocytes: a pilot study
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背景：青光眼是一种以视神经进行性退变为特征的致盲主要原因。通常与青光眼相关的眼内压升高会对视盘头产生生物力学应变，其中机械敏感性星形胶质细胞促进促纤维化细胞外基质重塑。转谷氨酰胺酶2等交联酶参与该过程。转谷氨酰胺酶2的独特功能是通过将血清素转酰胺到谷氨酰胺残基
背景：青光眼是一种以视神经进行性退变为特征的致盲主要原因。通常与青光眼相关的眼内压升高会对视盘头产生生物力学应变，其中机械敏感性星形胶质细胞促进促纤维化细胞外基质重塑。转谷氨酰胺酶2等交联酶参与该过程。转谷氨酰胺酶2的独特功能是通过将血清素转酰胺到谷氨酰胺残基上（“血清素化”）来催化蛋白质翻译后修饰。细胞外基质蛋白（如纤连蛋白）的血清素化可能参与细胞外基质重塑。此处，研究人员探讨视盘头星形胶质细胞是否能在生物力学损伤响应下对细胞外蛋白进行血清素化。
结果：接受0–12%循环拉伸24小时的原代人视盘头星形胶质细胞中，细胞外转谷氨酰胺酶2和血清素水平升高。相应地，通过免疫印迹检测的免疫沉淀纤连蛋白样品的血清素化在受拉伸细胞中高出2.5倍。通过纳米流液相色谱–电喷雾电离串联质谱（LC–MS/MS）的体外实验也证明转谷氨酰胺酶2的催化作用导致纤连蛋白特定谷氨酰残基的血清素化。
结论：这些发现表明纤连蛋白可被视盘头星形胶质细胞血清素化，且该修饰受生物力学应力增强。虽然转谷氨酰胺酶2通常与细胞外基质交联相关，但这些结果提示血清素化可能是转谷氨酰胺酶2在青光眼视盘头细胞外基质重塑中贡献的一种额外且未被探索的机制。
研究背景方面，青光眼作为致盲主要病因，其特征为视神经进行性退变，升高的眼内压（IOP）会对视盘头（ONH）产生生物力学应变，此处机械敏感的ONH星形胶质细胞参与促纤维化细胞外基质（ECM）重塑，蛋白交联酶如转谷氨酰胺酶2（TGM2，也称组织转谷氨酰胺酶、TGase 2、tTG、TG2）在其中发挥作用。TGM2除经典的赖氨酸?谷氨酰胺交联外，还可催化小分子生物源单胺（如血清素）的伯氨基与蛋白质谷氨酰胺残基转酰胺，即“单胺化”或特指的“血清素化（serotonylation）”。血清素在ONH中存在且具有促纤维化作用，既往研究显示TGM2可在C6胶质瘤细胞、主动脉平滑肌细胞中血清素化细胞外纤连蛋白并促进ECM蛋白聚集及参与病理重塑，但ONH星形胶质细胞是否能在青光眼相关生物力学应激下对ECM蛋白进行血清素化尚不清楚。理解ONH病理性重塑机制对开发保护视神经和视网膜的新疗法至关重要，因此研究人员开展此项初步研究，探讨ONH星形胶质细胞在模拟青光眼生物力学损伤下能否血清素化ECM蛋白及其与青光眼ONH重塑的潜在关联。该研究发表于《Matrix Biology Plus》。
为开展研究，研究人员使用的主要关键技术方法与样本来源包括：使用来自三位无眼部疾病的独立人供体（79岁白人男性、83岁白人女性、71岁白人男性）的原代人类ONH星形胶质细胞（生物重复n=3，传代4–5代）作为细胞模型；采用FlexCell FX?6000T可编程张力系统对接种于胶原IV预包被柔性底培养板的汇合细胞施加0–12%循环等双轴拉伸（1 Hz，24小时）以模拟青光眼生物力学应激，对照组维持0%拉伸；通过竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）定量条件培养基中血清素水平；利用免疫荧光检测血清素转运体（SERT）蛋白；通过免疫印迹（非还原条件）检测细胞外TGM2、血清素及纤连蛋白，并使用TGM2选择性不可逆抑制剂ZED1227（Vilagletistat，1 μM）处理验证TGM2依赖性；在体外用重组人TGM2（rhTGM2）、血清素与血浆来源纤连蛋白反应体系验证血清素化，并通过纳米流液相色谱–电喷雾电离串联质谱（LC–MS/MS）鉴定纤连蛋白上血清素化谷氨酰残基；通过抗纤连蛋白抗体免疫沉淀条件培养基中纤连蛋白后再进行血清素免疫印迹定量；统计分析采用Shapiro?Wilk正态性检验、配对双尾t检验及重复测量方差分析（RM ANOVA）结合Tukey HSD多重比较，数据以均值±标准差表示，p<0.05为显著。
研究结果部分保留原文小标题并依内容总结如下：
Higher serotonin concentrations are maintained in the culture medium of stretched ONH astrocytes：研究人员对接受0–12%循环拉伸24小时的ONH星形胶质细胞条件培养基用竞争性血清素ELISA检测，发现对照组平均细胞外血清素浓度为2.97±0.84 ng/mL，拉伸组为7.29±0.25 ng/mL，差异显著（p=0.018，配对t检验），表明拉伸ONH星形胶质细胞维持更高细胞外血清素水平；免疫荧光未观察到拉伸与对照间血清素转运体（SERT）水平或定位的明显变化，提示可能涉SERT功能改变或其他机制，且血清素共价结合可能仍暴露部分免疫原表位影响检测。
Stretch increases extracellular transglutaminase 2 levels：研究人员对浓缩条件培养基样品做TGM2免疫印迹，在~80 kDa处检测到特征性TGM2条带及~50–60 kDa已知非特异性条带，另有高分子量条带可能为TGM2交联的高分子量ECM蛋白；定量显示拉伸24小时ONH星形胶质细胞条件培养基中TGM2蛋白水平较对照升高2.57倍（p=0.025），提示拉伸提升细胞外TGM2水平，可能源于分泌增加或降解减少等。
Extracellular protein serotonylation appears to be elevated after stretch：研究人员对条件培养基总蛋白免疫印迹用抗血清素抗体检测，发现血清素信号主要关联>270 kDa高分子量条带，推测部分代表纤连蛋白结合血清素；定量归一化后拉伸组该信号较对照升高1.36倍（p=0.010），拉伸+ZED1227组较拉伸组降低1.47倍（p=0.004），表明拉伸增加纤连蛋白相关血清素信号且该关联依赖TGM2，提示拉伸刺激纤连蛋白血清素化，效应较温和可能与宽条带及纤连蛋白水平不一致有关。
In vitro validation of serotonin immunoblotting as a means of detecting serotonylated fibronectin：研究人员在含/不含血清素、rhTGM2及ZED1227的体外反应体系中制备纤连蛋白样品并免疫印迹，抗血清素抗体在含TGM2与血清素样品中产生与纤连蛋白重叠的清晰条带，缺血清素样品基本无条带，缺TGM2样品有微弱非特异性信号，加TGM2抑制剂减弱条带；纤连蛋白免疫印迹与总蛋白染色显示各条件纤连蛋白总量一致，活性TGM2存在时纤连蛋白迁移滞留于更高分子量，符合TGM2介导交联；进一步用LC–MS/MS分析体外反应样品，在血清素化纤连蛋白肽段检出谷氨酰残基上159 Da（176 Da血清素质量?17 Da NH3质量）血清素化标记，对照未检出，代表性质谱显示双电荷前体离子有79.5（159/2）m/z偏移，验证抗血清素抗体可特异性检测血清素化纤连蛋白且体外成功实现纤连蛋白血清素化。
Stretch increases the serotonylation of fibronectin in cellulo：研究人员用抗纤连蛋白抗体免疫沉淀条件培养基中内源性纤连蛋白后再做血清素与纤连蛋白免疫印迹，血清素信号主要见于>270 kDa高分子量条带（符合非还原纤连蛋白二聚体~500 kDa预期）；归一化定量显示0–12%循环拉伸24小时后纤连蛋白血清素化较对照升高2.49倍（p=0.008），表明在细胞水平拉伸增强纤连蛋白血清素化。
讨论部分总结：研究人员指出本研究主要发现为0–12%循环拉伸24小时后纤连蛋白血清素化增加，虽未直接在胞外证实分泌TGM2介导该过程，但观测到细胞外TGM2升高、细胞外血清素增加及低渗透性选择性TGM2抑制剂降低血清素化，与上述机制一致。纤连蛋白作为大型ECM糖蛋白，在ONH多种结构中存在，青光眼时ONH纤连蛋白及FN?EDA亚型表达增加，参与促纤维化重塑，其翻译后修饰（如血清素化）可能影响功能与ECM结构。血清素化可影响多类蛋白功能，纤连蛋白血清素化既往被认为促进ECM聚集与病理重塑，本研究检出的血清素化肽段部分位于或近纤连蛋白N端（对该蛋白组装关键），也可能位于中央或C端（影响细胞表面结合及其他分子相互作用），可能影响纤维基质最终结构与结合特性。ONH星形胶质细胞为机械敏感细胞，循环拉伸增加纤连蛋白血清素化提示生物力学应激可调控TGM2介导的ECM成分翻译后修饰，血清素化可能是TGM2影响青光眼ONH中ECM组织的机制之一，需进一步研究该修饰的功能后果，并拓展定义完整细胞外血清素化组及响应。研究人员也指出本研究局限：未在免疫沉淀样品中确认TGM2依赖性（因ZED1227干扰免疫沉淀效率），拟用遗传敲低/敲除TGM2解决；仅聚焦纤连蛋白，低分子量血清素信号提示其他ECM蛋白亦可能被血清素化；0–12%循环拉伸（约模拟50 mmHg IOP）为严重急性青光眼应激近似，无法完全重现ONH复杂慢性生物力学（周向应力、跨板层压差、剪切应力等），且培养板基底硬度（930 kPa）高于原生ONH、包被胶原IV亦影响表型，需扩展时间点、底物类型与应变程度；ONH内血清素丰度有限，是否足以驱动有意义血清素化及其他生物胺（如多巴胺、组胺）的单胺化亦待探明。即便独立于单胺化，本研究显示TGM2活性响应ONH星形胶质细胞生物力学应激，与组织中损伤促进TGM2释放至富钙胞外环境激活一致，ONH中TGM2经典交联功能本身亦未充分研究，未来对TGM2介导交联、单胺化及相关活性的研究可能揭示ECM重塑重要机制并提供青光眼新治疗靶点。
结论部分原文翻译为：总之，研究发现视盘头星形胶质细胞产生的转谷氨酰胺酶2可对纤连蛋白进行血清素化，且该活性受生物力学应力增强。鉴于纤连蛋白在细胞外基质组织中的核心作用，这些结果凸显了一种潜在未被探索的机制，即青光眼生物力学应力可能通过该机制促进视盘头重塑。虽需进一步工作明确纤连蛋白血清素化的功能后果及体内相关性，本研究初步表征了转谷氨酰胺酶2介导的翻译后修饰作为青光眼病理生理学中合理贡献者的特征。
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