重组L1R蛋白能诱导针对山羊痘病毒的交叉中和抗体，即便体液免疫反应处于次要地位

《Microbial Pathogenesis》：Recombinant L1R protein induces cross-neutralizing antibodies against capripoxviruses despite a subdominant humoral response

　　

摘要

山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及结节性皮肤病病毒这类山羊痘病毒属病毒，在亚洲、非洲、中东和欧洲地区给家养反刍动物带来了巨大的经济损失。识别能够引发保护性免疫的病毒抗原，以及了解抗原特异性体液反应的特征，对于合理开发疫苗和血清诊断方法至关重要。L1R是细胞内成熟病毒颗粒的一种重要膜蛋白，也是已知可用于针对痘病毒的中和抗体靶标。在本研究中，人们在大肠杆菌中表达了截短的L1R外域蛋白（rL1RΔTM；191个氨基酸；20.6千道尔顿），通过变性条件下的亲和层析技术对其进行纯化，随后使其重新折叠，从而获得具有抗原功能的蛋白质。通过SDS-PAGE和西方印迹法确认了该重组蛋白的表达情况。用纯化的rL1RΔTM给兔子接种后，可引发抗原特异性IgG反应，并产生针对山羊痘病毒的中和抗体。而基于rL1RΔTM的间接ELISA检测，使用自然感染或接种过疫苗的动物的血清进行测试后显示，L1R特异性抗体在山羊痘病毒特异性体液反应中所占比例很小。因此，rL1RΔTM ELISA方法的诊断特异性很高（98.7%-100%），但灵敏度较低（感染动物中为26%-39%，接种过疫苗的动物中为8%-22%）。此外，其与中和滴度之间的相关性也很弱（R2=0.11-0.18）。这些研究结果表明，L1R在自然体液免疫反应中的作用相对较弱，这限制了其作为独立抗原用于血清诊断的效用。不过，L1R是一种保守的免疫原，能够诱导针对山羊痘病毒的中和抗体，这一特性为其在开发广谱山羊痘病毒亚单位疫苗及单克隆抗体方面发挥作用提供了可能。

引言

病毒性疾病持续对全球畜牧业健康和粮食安全造成严重影响，因此需要不断创新疾病控制策略。其中，山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及结节性皮肤病病毒这类山羊痘病毒属病毒，在非洲、中东、亚洲以及欧洲部分地区给家养反刍动物带来了经济损失[1]。尽管从血清学角度来看这些病毒彼此无法区分，但可通过分子技术将它们区分开来[2]。目前的诊断方法，如病毒分离、血清中和试验以及分子检测方法，存在诸多局限性，比如工作量大、需要专门的实验室设施，且无法评估保护性免疫水平[3]。疫苗接种仍然是控制这些疾病的主要手段。然而，现有的减毒活疫苗效果存在差异，还存在病毒残留毒力问题，同时难以区分感染动物和已接种疫苗的动物（DIVA现象）。这些局限性凸显出迫切需要新型、安全且具有广泛效力的疫苗抗原以及能够解决DIVA问题的诊断工具。识别能够诱导中和抗体并可作为诊断标志物的病毒蛋白至关重要[4,5]。

在痘苗病毒中研究的各种病毒蛋白中，L1R因其在水痘病毒入侵过程及免疫原性形成中的关键作用，成为了一个极具前景的靶标。痘病毒复制后会生成两种具有感染性的形式：负责在宿主间传播的细胞内成熟病毒颗粒，以及有助于实现宿主间传播的细胞外包膜病毒颗粒[6]。L1R是一种肉豆蔻酰化的细胞内成熟病毒颗粒膜蛋白，对于病毒颗粒的附着和入侵不可或缺，同时也是中和抗体的主要靶标[7]。研究表明，L1R能够在多种疫苗平台以及动物模型中引发保护性免疫[8,9]。由于L1R在各类痘病毒中都保持高度保守，其已明确的功能为研究其在山羊痘病毒中的功能及潜在应用提供了依据。山羊痘病毒之间存在较高的序列一致性[10]，这一特点表明L1R有望成为广谱山羊痘病毒免疫原和诊断标志物。

不过，目前对于L1R的免疫原性、诊断价值，以及它在自然感染或疫苗接种后对整体体液免疫反应的具体贡献，仍缺乏全面了解[11,12]。为填补这些研究空白，本研究旨在：（1）以能够保留与中和作用相关的抗原表位的形式表达并纯化重组L1R；（2）评估其免疫原性及其诱导中和抗体的能力；（3）分析在自然感染或疫苗接种后，L1R特异性抗体在整体体液免疫反应中所占的比例。这些研究结果将有助于我们更深入地了解山羊痘病毒相关免疫机制，同时明确L1R作为未来诊断试剂和新一代疫苗候选抗原的潜力与局限。

章节节选

病毒、载体、细菌菌株及实验动物

该研究使用的GTPV-Uttarkashi菌株保存在印度ICAR-IVRI穆克特斯瓦尔的病毒学部门痘病毒实验室中，该菌株在Vero细胞（ATCC CCL-81）中以0.01的感染复数进行培养，作为病毒DNA的来源。克隆工作则使用了原核表达载体pET-33b(+)（美国Novagen公司出品）。大肠杆菌TOP10F’（美国Invitrogen公司出品）被用作克隆宿主，而Rosetta-gami B（DE3）（美国Novagen公司出品）则因其具有氧化性的细胞质而被用于蛋白质表达。

生物信息学分析与蛋白质建模

GTPV的全长L1R蛋白由245个氨基酸组成，分子量为26.8千道尔顿，它包含一个外域（从第1个氨基酸M到第183个氨基酸G）、一个预测的跨膜结构域（从第184个氨基酸Y到第204个氨基酸V），以及一个较短的细胞质尾部（从第205个氨基酸K到第245个氨基酸K）（见图1A和C）。结构预测结果显示，该蛋白的外域具有较高的抗原指数、亲水性，表面概率也很高。该蛋白质构建体经过设计，使得只有L1R的外域部分（1-183号氨基酸）能在pET-33b(+)载体中表达。该重组蛋白含有

讨论

鉴于山羊痘病毒会给生产带来巨大损失，因此亟需更安全的预防措施以及可靠的诊断工具[18,19]。所以，必须研究山羊痘病毒的相关免疫原蛋白，以便开发出更安全的诊断方法和预防产品。L1R蛋白作为一种重组蛋白、DNA疫苗以及病毒载体，已在小鼠、兔子和非人灵长类动物中被广泛用于研究其免疫原性和保护功效，相关研究结果见表2。

结论

综上所述，重组L1R具有结构保守性、免疫原性，还能引发强烈的中和抗体，因此它是开发针对山羊痘病毒的亚单位疫苗的优质候选蛋白。不过，在自然感染或疫苗接种后，L1R特异性反应较为微弱，所起作用也相对次要，这限制了其作为血清学标志物的应用价值。尽管存在这一局限，L1R仍具备保留功能性表位并诱导交叉中和抗体的能力。

CRediT作者贡献说明

阿米特·库马尔：概念构思、正式分析、研究方法、初稿撰写、审稿与编辑。莫努·卡尔基：研究实施、研究方法。阿南德·库什瓦哈：研究方法。阿斯温·P·库马尔：研究实施、研究方法。普林卢·古尔梅伊：研究方法。安基特·普拉萨德·凯尔万：研究方法。杜尔加·戈斯瓦米：研究方法。格纳纳维尔·文卡特桑：资金筹集、审稿与编辑。普罗纳布·达尔：资金筹集、项目监督。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关联或个人关系。

致谢

本研究得到了印度农业研究委员会以及印度政府农业研究教育部门的支持。作者们感谢ICAR-印度兽医研究所的所长，以及CRP-V&D项目的协调人，他们为这项研究的开展提供了必要的条件。

阿米特·库马尔|莫努·卡尔基|阿南德·库什瓦哈|阿斯温·P·库马尔|普林卢·古尔梅伊|安基特·普拉萨德·凯尔万|杜尔加·戈斯瓦米|格纳纳维尔·文卡特桑|普罗纳布·达尔

印度北阿坎德邦穆克特斯瓦尔，ICAR-印度兽医研究所