《Microbial Pathogenesis》：Anti-Toxoplasma gondii activity of two novel synthetic compounds based on pyridine, benzimidazole and benzoxazole scaffolds in human maternal-fetal interface models
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先天性弓形虫病仍是一个主要的公共卫生问题，目前使用磺胺嘧啶（sulfadiazine）和乙胺嘧啶（pyrimethamine）的治疗受限于毒性和疗效，凸显了对更安全替代方案的需求。本研究使用BeWo细胞和人妊娠晚期绒毛外植体作为母胎界面模型，评估了含有吡啶、苯
先天性弓形虫病仍是一个主要的公共卫生问题，目前使用磺胺嘧啶（sulfadiazine）和乙胺嘧啶（pyrimethamine）的治疗受限于毒性和疗效，凸显了对更安全替代方案的需求。本研究使用BeWo细胞和人妊娠晚期绒毛外植体作为母胎界面模型，评估了含有吡啶、苯并咪唑和苯并恶唑骨架的两种新型合成化合物RVI 30和RVI 33的抗刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）活性。通过MTT法评估细胞和组织活力；通过β-半乳糖苷酶（β-galactosidase） assay评估寄生虫增殖和入侵；通过透射电子显微镜评估超微结构改变；通过差异免疫荧光评估黏附和入侵；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估细胞因子产生。两种化合物在非细胞毒性浓度下降低了刚地弓形虫的增殖，显示出良好的选择性指数（selectivity indices）。抗寄生虫效应呈剂量依赖性且部分不可逆。研究人员的结果还显示，这些化合物与刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（TgDHFR）的结合最佳。超微结构分析揭示了速殖子的损伤，包括细胞器破坏和膜改变，与直接的杀寄生虫活性一致。速殖子或宿主细胞的预处理减少了入侵，表明对寄生虫和宿主均有影响。在感染的BeWo细胞中，两种化合物均上调了巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），而RVI 30还下调了白细胞介素-8（IL-8），提示免疫调节机制。重要的是，两种化合物均不影响外植体的活力，但均降低了寄生虫增殖，疗效优于磺胺嘧啶加乙胺嘧啶，且未破坏局部细胞因子稳态。这些发现表明，RVI 30和RVI 33通过在母胎界面直接损伤寄生虫及调节入侵和炎症通路，发挥有效的抗刚地弓形虫活性，支持其作为治疗候选物的潜力。
该研究发表于《Microbial Pathogenesis》，针对先天性弓形虫病现有疗法磺胺嘧啶与乙胺嘧啶存在骨髓抑制、致畸等毒性及疗效有限、部分虫株耐药的问题，以人母胎界面感染控制与胎儿保护平衡难题为背景，开展含吡啶、苯并咪唑、苯并恶唑骨架的新型合成化合物RVI 30（C19H12N6O2S2）与RVI 33（C19H10N4O4S2）的抗刚地弓形虫活性评价，证实二者在低非细胞毒性浓度下具剂量依赖、部分不可逆抗寄生虫效应，对人妊娠晚期绒毛外植体无毒性且疗效优于经典联合疗法，可通过直接损伤速殖子超微结构、调控宿主与寄生虫入侵及炎症通路发挥作用，分子对接显示其与刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（TgDHFR）结合最佳，为母胎界面弓形虫感染治疗提供了潜在候选化合物。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：以人滋养层细胞系BeWo及巴西联邦乌贝兰迪亚大学临床医院收集的妊娠36至40周择期剖宫产所得人妊娠晚期绒毛外植体（样本排除子痫前期、高血压、心脏病、糖尿病、弓形虫病感染等干扰因素，经伦理批准并获受试者知情同意）为母胎界面模型；采用MTT比色法检测细胞与组织活力；采用β-半乳糖苷酶比色法量化刚地弓形虫速殖子增殖；采用透射电子显微镜观察速殖子超微结构；采用红绿抗体差异染色结合共聚焦荧光显微镜评估黏附与入侵；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子；采用分子对接模拟化合物与刚地弓形虫靶标结合亲和力。
RVI 30和RVI 33仅在高浓度下降低BeWo细胞活力
研究人员通过MTT法检测发现，RVI 30与RVI 33在50至200 μM高浓度下较未处理对照组显著降低BeWo细胞活力（P < 0.05），溶剂二甲基亚砜（DMSO）不影响细胞活力，因此后续寄生虫增殖评估选用低于50 μM的非细胞毒性浓度。
RVI 30和RVI 33降低刚地弓形虫细胞内增殖，发挥剂量依赖性不可逆抗寄生虫效应并诱导速殖子超微结构改变
研究人员在感染BeWo细胞中用非细胞毒性浓度处理24小时检测寄生虫生长，RVI 30在6.25至25 μM、RVI 33在所有测试浓度下均较未处理细胞显著降低寄生虫复制（P < 0.05），磺胺嘧啶加乙胺嘧啶（SDZ + PYR）亦显著降低复制。计算得其半数抑制浓度（IC50）与半数细胞毒性浓度（CC50）及选择性指数（SI = CC50/IC50）为：RVI 30 IC50=3.418 μM、CC50=171.6 μM、SI=50.20；RVI 33 IC50=5.49 μM、CC50=81.55 μM、SI=14.84。撤药后仅12.5 μM高浓度及SDZ + PYR维持不可逆寄生虫负荷降低（P < 0.05）。透射电子显微镜显示未处理感染细胞速殖子呈典型新月形、双层膜、棒状体、线粒体及微管泡网络正常；处理后寄生泡内速殖子出现多个液泡样结构（VLS）、细胞器破坏及双层膜损伤（红色箭头头示），证实严重形态学改变与生长停滞。
经RVI 30和RVI 33预处理的刚地弓形虫速殖子入侵率降低
研究人员将游离速殖子用6.25 μM与12.5 μM RVI 30、RVI 33或SDZ + PYR预处理1小时后再感染BeWo细胞3小时，β-半乳糖苷酶法检测显示预处理速殖子入侵能力较未处理（培养基对照）显著降低（P < 0.05），且RVI 30与RVI 33预处理组入侵指数低于SDZ + PYR组（P < 0.05），表明化合物直接作用于刚地弓形虫速殖子。
经RVI 30和RVI 33预处理的BeWo细胞显示刚地弓形虫入侵减少
研究人员用6.25、12.5、25 μM RVI 30、RVI 33或SDZ + PYR预处理BeWo细胞24小时后感染3小时，红绿差异免疫荧光染色显示各组黏附无变化，但入侵指数（细胞内寄生虫数）较未处理显著降低（P < 0.05）；RVI 30（12.5、25 μM）与RVI 33（6.25至25 μM）处理组细胞内寄生虫数少于SDZ + PYR组（P < 0.05），共聚焦图像证实绿色 intracellular 速殖子减少，表明化合物亦直接作用于宿主BeWo细胞。
感染刚地弓形虫并用RVI 30或RVI 33处理的BeWo细胞上调MIF，仅RVI 30下调IL-8
研究人员用ELISA检测BeWo上清细胞因子，未感染细胞中RVI 30升高MIF与IL-8（P < 0.05），RVI 33升高IL-6与IL-8（P < 0.05）；感染状态下未处理细胞仅上调MIF（P < 0.05），感染后用RVI 30处理细胞较未处理感染细胞MIF升高、IL-8降低（P < 0.05），且较SDZ + PYR处理组IL-6升高、IL-8降低（P < 0.05）；RVI 33处理感染细胞较未处理及未感染细胞均升高MIF（P < 0.05）；SDZ + PYR在未感染与感染细胞中均上调MIF、下调IL-6（P < 0.05）；TNF与IL-4低于ELISA检测限。
RVI 30和RVI 33未引起人绒毛外植体活力任何变化
研究人员以MTT法检测人妊娠晚期绒毛外植体经RVI 30与RVI 33（6.25至200 μM）处理24小时后的活力，所有浓度均未较未处理外植体引起显著变化，1.2% DMSO亦无影响；苏木精-伊红染色显示12.5与25 μM处理组外植体滋养层、间充质及血管结构完整，无组织破坏，与未处理组一致。
RVI 30和RVI 33显著减少人绒毛外植体中刚地弓形虫增殖
研究人员感染人绒毛外植体后用6.25至200 μM RVI 30、RVI 33或SDZ + PYR处理24小时，β-半乳糖苷酶法检测显示所有浓度RVI 30与RVI 33均较未处理绒毛外植体显著降低寄生虫复制（P < 0.05），且效果优于SDZ + PYR（P < 0.05）；外植体中MIF、IL-6、IL-8、TNF无显著变化，IL-4低于检测限。
In silico analysis
研究人员通过分子对接模拟评估化合物与刚地弓形虫靶标结合亲和力，结果显示RVI 30与RVI 33与刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（TgDHFR）结合最佳，可在底物结合位点附近形成疏水、静电及氢键相互作用，完整相互作用列于补充表S2与S3。
讨论部分总结：全球约三分之一人口感染刚地弓形虫，含吡啶、苯并咪唑、苯并恶唑骨架化合物具多疾病治疗潜力；本研究首次在母胎界面模型（BeWo细胞及人绒毛外植体）证实此类骨架抗刚地弓形虫活性，RVI 30与RVI 33的IC50低且SI良好，所需浓度远低于经典疗法SDZ + PYR，与既往苯并咪唑、吡啶衍生物研究数值可比，且首次报道苯并恶唑与苯并咪唑骨架致刚地弓形虫速殖子超微结构改变；撤药后高浓度不可逆效应与超微结构损伤一致；速殖子与宿主细胞预处理均降入侵且优于SDZ + PYR，提示可能调控如细胞间黏附分子1（ICAM-1）等宿主分子；BeWo中上调MIF（助抗寄生虫防御）与RVI 30下调IL-8（既往关联复制控制）具免疫调节贡献；人绒毛外植体无细胞毒性、高效降增殖且不扰细胞因子稳态，契合妊娠免疫稳态维持需求；分子对接示其与TgDHFR（乙胺嘧啶靶标，关联毒性）结合佳，为机制提供线索；整体体内外与计算机模拟支持RVI 30与RVI 33作为母胎界面抗刚地弓形虫治疗候选物的转化价值。
研究结论部分原文翻译：研究表明，全球约三分之一的人口感染刚地弓形虫，这是一个主要的公共卫生问题，尤其是在非发达国家。含有吡啶、苯并咪唑和苯并恶唑骨架的化合物在治疗包括弓形虫病在内的多种疾病中显示出疗效。因此，在本研究中，研究人员旨在探讨基于吡啶、苯并咪唑和苯并恶唑骨架的两种新型化合物（RVI 30和RVI 33）在人母胎界面模型中对抗刚地弓形虫感染的效果。研究人员首先评估了递增浓度RVI 30和RVI 33处理后BeWo细胞的活力。较高浓度（50-200 μM）降低了BeWo细胞活力，RVI 30和RVI 33的CC50值分别为171.6 μM和81.55 μM。随后，感染的BeWo细胞用每种化合物的非细胞毒性浓度处理24小时。所有测试浓度的RVI 33均显著降低细胞内寄生虫增殖，而RVI 30仅在6.25至25 μM浓度范围内在BeWo细胞中表现出高效力。此外，RVI 30和RVI 33均对寄生虫生长表现出不可逆的剂量依赖性效应。RVI 30和RVI 33的IC50值分别为3.418 μM和5.49 μM。这些IC50值尤其值得注意，因为它们表明相对较低的浓度就足以显著抑制寄生虫生长而不损伤宿主细胞。此外，IC50与CC50值之间的显著差异表明良好的选择性特征（SI：50.20和14.84），突出了两种化合物的安全性和治疗潜力。值得注意的是，标准磺胺嘧啶和乙胺嘧啶组合需要800 μM和32 μM的浓度才能在BeWo细胞中使刚地弓形虫生长降低50%。因此，RVI 30和RVI 33在比传统疗法所需浓度低数倍的浓度下实现了相当的感染抑制效果，强化了其令人鼓舞的抗寄生虫功效。根据数据，各种吡啶、苯并咪唑和苯并恶唑结构已被研究用于多种病原体。吡啶衍生物已显示对恶性疟原虫和锥虫感染具抗寄生虫潜力，最近在小鼠模型中降低刚地弓形虫负荷。苯并咪唑衍生物亦被研究用于多种病原体，包括蠕虫、细菌、真菌、病毒及疟疾、利什曼病和锥虫病等原虫疾病，少数研究探索其治疗弓形虫病，近期合成系列吡rimido[1,2-a]苯并咪唑化合物在Vero细胞中识别两个有前景选择性抗寄生虫候选物，苯并咪唑抑制剂家族在人成纤维细胞中对刚地弓形虫具良好疗效，三氯苯达唑在人成纤维细胞中对刚地弓形虫具高选择性。苯并恶唑衍生物亦显示抗菌与抗病毒活性，尚无研究涉及其在刚地弓形虫感染背景中的活性。至今尚无研究在人母胎界面感染期间检查这些骨架。因此，本研究首次证明吡啶、苯并咪唑和苯并恶唑骨架在母胎界面模型（如BeWo细胞）中对刚地弓形虫感染的潜力。接下来，研究人员探讨了RVI 30和RVI 33触发寄生虫生长控制的可能机制。首先评估化合物对寄生虫结构的影响，结果显示用RVI 30或RVI 33处理的细胞内含多个液泡样结构（VLS）、细胞器破坏及双层膜损伤的寄生虫，与严重形态学改变和生长停滞一致。发现与先前含吡啶核化合物处理刚地弓形虫速殖子膜超微结构变形报告一致；类似地，苯并咪唑衍生物通过强效抑制寄生虫精氨酸酶减少墨西哥利什曼原虫无鞭毛体与前鞭毛体数量；硝基唑尼特-N-甲基-1H-苯并咪唑亦诱导肠贾第鞭毛虫细胞骨架蛋白表达显著改变及鞭毛末端大球状结构、膜缘弯曲与腹区凹陷；苯并咪唑衍生物对恶性疟原虫早晚期配子体有效，其他研究显示苯并咪唑骨架干扰血红素结晶增强抗疟活性。至今尚无研究证明刚地弓形虫超微结构改变与苯并恶唑或苯并咪唑骨架处理直接关联，因此本研究首次提出此机制。总之，结果表明用RVI 30或RVI 33处理后刚地弓形虫生长显著减少至少部分与速殖子结构损伤有关，撤药实验进一步支持此结论：高浓度RVI 30和RVI 33防止撤药后寄生虫生长恢复。为成功建立感染，寄生虫须黏附宿主细胞膜、入侵并在宿主细胞内复制。因此探明化合物RVI 30或RVI 33处理是否直接在宿主细胞感染前影响寄生虫表面，观察到速殖子用RVI 30或RVI 33预处理1小时入侵率显著降低，较SDZ + PYR更有效，表明两化合物可能直接作用于寄生虫尤其是改变其表面。既往研究显示几种弓形虫病替代治疗候选物诱导刚地弓形虫不规则粗糙表面、质膜破裂伴孔洞、扭转及形状显著改变，因此假设速殖子用RVI 30和RVI 33处理可能发生类似现象，但需未来研究确认。有趣的是，BeWo细胞用两RVI预处理后仅入侵率改变，处理再次显示较SDZ + PYR更有效，故可得出结论处理在宿主细胞水平亦有效，不仅限于寄生虫，提示除速殖子超微结构改变外另有机制。已知宿主细胞膜若干结构域对寄生虫入侵重要，RVI 30和RVI 33可能调节参与入侵的某些宿主分子，研究显示细胞间黏附分子1（ICAM-1）是刚地弓形虫利用入侵宿主细胞的重要表面蛋白，近期证明阻断ICAM-1可抑制BeWo细胞及人妊娠晚期绒毛外植体中刚地弓形虫入侵，故可能两RVI干扰ICAM-1表达从而减少BeWo细胞刚地弓形虫入侵，但需未来研究确认。综上——速殖子或BeWo细胞用两RVI预处理入侵率显著降低、较经典药（SDZ + PYR）更好控制入侵及RVI良好选择性指数——可得出结论：这些新型吡啶、苯并咪唑和苯并恶唑衍生物是母胎界面抗刚地弓形虫的有前景替代化合物，可能优于常规治疗。此外，检测细胞因子评估两化合物潜在免疫应答调节，选用参与抗刚地弓形虫免疫应答且存在于母胎界面的细胞因子面板，发现RVI 30和RVI 33均增加BeWo细胞MIF。弓形虫病中MIF关联多种助宿主防御的活动，MIF缺陷动物对实验刚地弓形虫感染高度易感，多器官严重病理因早期促炎反应受损及寄生虫负荷增加；既往研究显示人滋养层及绒毛外植体刚地弓形虫感染后MIF增加，MIF是不论治疗与否在人母胎界面模型抗感染的重要策略；亦观察到BeWo细胞用RVI 30处理时IL-8下调，既往工作显示感染刚地弓形虫的THP-1细胞被环氧化酶-2（COX-2）抑制时IL-8低水平，有助控制寄生虫复制；先前显示感染刚地弓形虫的BeWo细胞用多叶苦木油树脂处理下调IL-8，对控制速殖子复制重要；重组P21（克氏锥虫关键蛋白）在BeWo细胞引发较低IL-8水平并在模拟共感染的人母胎界面模型中减少刚地弓形虫复制。因此假设RVI 30处理细胞低IL-8可能有助于控制刚地弓形虫，提出MIF上调联合IL-8负调控可能除电镜观察的寄生虫超微结构直接影响外贡献感染控制。并行研究两化合物对人妊娠晚期绒毛外植体的影响，胎盘绒毛外植体模型接近体内妊娠生理条件，保留母胎界面三维架构、细胞异质性与微环境，是验证细胞系体外发现的最合适离体模型之一。测试的RVI 30和RVI 33浓度无细胞毒性且在胎盘绒毛外植体显著减少刚地弓形虫增殖，显示较经典治疗（SDZ + PYR）更高效；绒毛外植体处理后细胞因子谱无显著改变，虽BeWo细胞中调制MIF与IL-8，绒毛与外植体细胞因子模式差异预期因绒毛外植体含多种细胞类型（滋养层、基质细胞、内皮细胞、常驻免疫细胞）而BeWo为单一滋养层谱系，外植体不同细胞组成可能导致细胞因子反应变异；母胎界面免疫稳态维持对防胎儿排斥及确保妊娠进展至关重要，故能保留局部免疫环境同时控制寄生虫感染的化合物是预防或减轻妊娠与先天性弓形虫病的理想治疗候选物；这些发现佐证BeWo细胞结果（亦显著减少寄生虫生长），治疗后寄生虫超微结构改变进一步支持RVI 30和RVI 33直接抗寄生虫效应，形态改变可能是寄生虫负荷减少的关键机制，表明刚地弓形虫结构损伤可能是复制与活力受损的主要贡献者。最后，分子对接模拟探究作用机制是治疗药物发现的重要步骤，在此背景下验证化合物结合刚地弓形虫二氢叶酸还原酶胸苷酸合酶（TgDHFR）底物结合位点附近，TgDHFR是将dUMP转为dTMP参与DNA合成的关键酶，是长期用于弓形虫病治疗且关联严重副作用的乙胺嘧啶的靶标，众多研究强调新型分子针对TgDHFR药物开发潜力；尽管确切抗寄生虫机制尚未完全阐明，结果提供化合物抗原虫潜力以开发有效抗刚地弓形虫分子的宝贵见解。总之，体外与离体数据强化RVI 30和RVI 33抗刚地弓形虫活性并支持其作为潜在治疗替代物的转化相关性，基于分子对接的计算机模拟有助于阐明RVI 30和RVI 33作用于此重要寄生虫的潜在机制。
