《Microbiology Resource Announcements》：Fast, robust UHPLC-DAD method for the simultaneous quantification of 31 multi-class polyphenols in diverse fruit matrices
编辑推荐：
•首次实现了对三种香豆酸异构体以及其他28种多酚的分离。•在15.36分钟内实现了31种多酚的高质量分离。•通过线性关系、检测限、定量限以及回收率计算，验证了该方法的灵敏度。•已在整果及果肉样本上验证了该方法的定量准确性及其适用性。引言植物会合成多酚作为次生代谢产物，以此抵御非生
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首次实现了对三种香豆酸异构体以及其他28种多酚的分离。
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在15.36分钟内实现了31种多酚的高质量分离。
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通过线性关系、检测限、定量限以及回收率计算，验证了该方法的灵敏度。
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已在整果及果肉样本上验证了该方法的定量准确性及其适用性。
引言
植物会合成多酚作为次生代谢产物，以此抵御非生物和生物因素引发的氧化应激。在非生物和生物胁迫作用下[1]，植物的多酚生物合成通常会被激活，且对植物的抗逆性至关重要。这些多酚主要通过莽草酸途径和丙二酸途径合成，相关合成过程由多种特异性酶参与，包括苯丙氨酸氨解酶（PAL）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）以及多酚氧化酶（PPOs）。莽草酸途径产生的色原酸可进一步用于合成芳香族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸），而这些氨基酸又会生成包括肉桂酸、香豆酸及其衍生物在内的多种多酚[2]。后续的代谢反应还会产生查尔酮衍生的柚皮素、山奈酚、槲皮素、异鼠李素、二氢杨梅素、杨梅素和芦丁等[3]、[4]、[5]。同样，丙二酸辅酶A作为丙二酸途径中的关键前体，也参与了多酮类物质和多酚的合成[6]。此外，生物合成途径中不同层面的酶和辅因子可通过将多酚转化为羟基化、甲基化和糖基化衍生物来影响其化学结构。这类结构变化在植物中具有重要的防御作用，同时也有益于人类健康。几十年来，人们一直致力于研究这些多酚的生物活性，发现它们具有减少活性氧（ROS）、抗炎[7]、预防心血管疾病[8]、控制糖尿病[9]、预防癌症[10]以及有益肠道微生物群[11]等多种功效。因此，提升多酚定量的准确性对于评估水果品质、检测功能性生物标志物以及分析营养成分具有重要意义。
近年来，分析仪器以及基于软件的HPLC和UHPLC梯度分离技术的进步，显著提升了多酚定量的精度。新开发的色谱方法在各类针对特定作物的研究中实现了高质量的多酚鉴定[12]、[13]。这类方法虽适用于大多数目标分析，但所能检测的多酚种类有限，且往往只针对特定的化学类别，同时还需要较长的分析时间（30–60分钟）。目前，这类检测方法由于流速较高、溶剂消耗量大，导致分析耗时且成本高昂。此外，多酚在极性和结构方面存在较大的化学多样性，尤其是功能团的数量差异，这也容易导致共洗脱现象和峰形过宽，进而影响分析的定量精度。另外，由于代谢组的多样性（如杂交种、基因型差异），不同植物样品中的多酚结构各异，含量也不尽相同，单一种类色谱梯度无法实现全面检测。因此，针对多种作物优化的新型HPLC/UPLC梯度方法，能够帮助研究人员检测更广泛的多酚种类。
鉴于上述挑战，本研究优化了一种通用且全面的UHPLC梯度方案，用于识别常见水果作物中的关键前体多酚和主要多酚生物标志物，这些作物包括各种浆果、橙子、苹果、火龙果、番茄和石榴。研究中对所有关键的分析参数进行了监控和优化，包括色谱柱的选择性、流动相成分以及仪器参数（时间梯度程序、色谱柱温度、进样量、分析物数量和流速）等，以确保分离效果。为避免影响分析精度，还在不同的紫外检测波长下测试了方法的检测限和定量限。在优化过程中，还密切监测了系统的适用性，并对容量因子等关键色谱参数进行了评估。总体而言，这一方案能够为植物育种者、食品科学家以及那些希望在不同水果样品中准确检测多种多酚的行业提供有力支持。考虑到该方法的可靠性、较短的分析时间以及较低的溶剂消耗，其在成本控制方面也具有明显优势。
章节摘要
材料
所使用的多酚标准品包括：没食子酸（≥99%）(1)、原儿茶酸（≥97.0%）(2)、4-羟基苯甲酸（≥99%）(3)、儿茶素（≥97.0%）(4)、绿原酸（≥95.0%）(5)、香草酸（≥97.0%）(6)、咖啡酸（≥98.0%）(7)、表儿茶素（≥98.0%）(8)、金丝桃素（≥98.0%）(9)、对香豆酸（≥98.0%）(10)、7-羟基香豆素（≥95.0%）(11)、阿魏酸（≥99%）(12)、芥子酸（≥98.0%）(13)、间香豆酸（≥95.0%）(14)、槲皮素-3-4-二葡萄糖苷（≥90%）(15)、芦丁（≥94.0%）(16)。
方法开发中的样品与多酚选择标准
植物中的膳食多酚有三分之一为酚酸类物质[14]。本研究通过大量文献综述，筛选出了多种食物（水果、蔬菜、谷物和坚果）中含量较高的酚酸类物质和黄酮类物质，这些物质被用于开发当前的UHPLC梯度分析方法（详见补充表1及参考文献）。该综述还证明了现有方法在园艺研究、食品科学以及食品工业领域中其他可食用材料分析中的应用潜力。
结论
本研究首次开发并验证了一种快速、经济且重复性极高的UHPLC-DAD梯度分析方法，该方法能够有效分离存在于多种水果样品中的所有香豆酸异构体（邻位、间位和对位异构体）以及其他28种多酚。通过优化时间-溶剂梯度程序，该方法获得了出色的色谱性能，使得各组分的保留时间、峰面积和峰高均十分稳定，从而能够在复杂样品中实现准确的定量分析。
CRediT作者贡献说明
Vikas Dadwal：论文撰写——审阅与编辑、原始稿撰写、数据可视化、方法验证、方法学设计、实验研究、正式数据分析、数据整理、概念构思。Deepak Kumar Jha：论文撰写——审阅与编辑、方法学设计、实验研究。Suraj Wayapalkar：方法学设计。Bhimanagouda S. Patil：论文撰写——审阅与编辑、方法验证、项目监督、资源协调、项目管理、实验研究、资金申请、正式数据分析。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢VFIC的研究人员在实验期间在样品制备和提取方面给予的直接和间接帮助。
资助与致谢
本研究得到了USDA-NIFA-2024-51181-43464项目的资助，该项目由德州农工大学的蔬菜水果改良中心下属的甜瓜国家卓越中心负责实施。
Vikas Dadwal|Deepak Kumar Jha|Suraj Wayapalkar|Bhimanagouda S. Patil
