双锁结构dCas13a/crRNA与双链特异性核酸酶级联反应，用于超高灵敏度且精确检测卵巢癌相关环状RNA

《Microchemical Journal》：Dual-locking dCas13a/crRNA and duplex-specific nuclease cascade for ultrasensitive and accurate detection of ovarian cancer-related circular RNA

　　

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  一种整合了dCas13a/crRNA与DSN的双重锁定级联反应机制，能够实现对circRNA的BSJ区域以及另一个独特区域的精准识别。
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  通过环形探针设计以及基于微球的分离技术，可以有效降低非特异性背景信号，从而实现可靠的circRNA检测。
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  该检测平台具有极高的灵敏度，检测下限可达0.16 fM，同时具备从0.5 fM到200 pM的宽线性检测范围。
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  得益于双重识别机制，该平台能够有效区分单碱基差异以及同源circRNA。
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  在癌细胞及添加了目标分子的血清样本中的验证结果表明，该平台有望用于卵巢癌的液体活检检测。

引言

卵巢癌依然是全球范围内致命性最高的妇科恶性肿瘤之一，这主要是因为其早期缺乏特定的症状以及可用于早期检测的可靠生物标志物，因此大多数患者都是在疾病晚期才被确诊[1]、[2]、[3]。近年来，环状RNA作为一种内源性非编码RNA逐渐受到重视，这类RNA具有共价闭合环结构，因而具备较高的稳定性，且不易被外切酶降解[4]、[5]。越来越多的证据表明，卵巢癌组织及体液中的环状RNA往往存在表达异常，它们可通过miRNA海绵效应或蛋白质支架等功能，对肿瘤的发生、增殖、侵袭以及化疗耐药性等过程起到关键调控作用[6]。由于环状RNA具有异常的表达模式和高稳定性，因此有望成为用于卵巢癌诊断和预后评估的无创生物标志物[7]。因此，开发出灵敏、特异且快速的环状RNA检测方法具有重要的临床意义，有助于提高卵巢癌的早期诊断率以及治疗过程中的监测效果。

目前，已有多种技术被用于环状RNA的检测，包括逆转录定量PCR（RT-qPCR）[8]、Northern blotting[9]以及RNA测序[10]、[11]。尽管这些方法应用广泛，但它们存在灵敏度较低、操作耗时较长或需要昂贵检测设备等缺陷。而等温核酸扩增技术，如滚环扩增（RCA）[12]、[13]、环介导等温扩增（LAMP）[14]、[15]以及指数扩增反应（EXPAR）[16]、[17]，则因能够在无需热循环的恒定温度条件下快速完成扩增，而成为颇具前景的替代方案。其中，RCA因其高进程性、温和的反应条件，以及能够从环状模板中生成长串联重复序列的特性，在环状RNA分析领域受到了广泛关注[18]、[19]。然而，传统的基于RCA的检测策略往往缺乏足够的序列特异性，容易产生假阳性信号。此外，现有的大多数检测方法主要只能识别环状RNA的背剪接连接区域（BSJ），而忽视了相邻的外显子序列等其他重要区域，这也限制了检测的准确性和特异性。最近，有一些基于CRISPR的单分子分析技术以及基于FRET的纳米传感器平台被用于环状RNA的检测，这些技术提升了检测的灵敏度和特异性[20]、[21]、[22]。

为了解决上述问题，一种名为双链特异性核酸酶（DSN）的耐热核酸酶逐渐引起了人们的兴趣，这种核酸酶能够优先切割DNA-RNA杂合双链中的DNA链，而对单链DNA或RNA几乎无作用[23]。DSN具有很高的互补识别特异性，因此非常适合用来区分完全匹配的杂交分子与存在差异的分子，为精准识别环状RNA提供了有力工具[24]。与此同时，CRISPR系统也因其可编程的靶向能力以及多样的酶学功能，彻底改变了核酸检测的方式。在各种CRISPR效应蛋白中，有两种在我们所设计的检测系统中受到了特别关注[25]。首先，催化活性较低的Cas13a（dCas13a）能够在crRNA的引导下特异性地结合到单链RNA上，但不会对其进行切割，从而实现高度特异且不会破坏RNA结构的识别功能[26]。当dCas13a与DSN结合使用时，便能在DNA和RNA两个层面为环状RNA提供双重识别机制。其次，Cas12a（也称为Cpf1）在与其靶向的DNA序列（如由环状RNA衍生的RCA产物）结合后，会表现出强烈的横向切割活性，能够非特异性地切割附近的单链DNA荧光报告分子，进而产生强烈的信号放大效应[27]。

基于上述思路，我们通过整合dCas13a/crRNA与DSN，开发了一种用于卵巢癌相关环状RNA分析的双重识别荧光检测平台。该策略能够实现对环状RNA序列的高度特异性的双重靶点识别。在此方法中，我们创新性地设计了环形锁形探针，用以解决传统滚环扩增过程中常见的背景信号过高的问题。通过将RCA技术与Cas12a/crRNA介导的RCA产物识别及切割功能相结合，我们的检测平台在检测卵巢癌相关环状RNA方面展现了出色的性能。令人印象深刻的是，该平台的检测下限低至0.16 fM，体现了极高的灵敏度。凭借其高特异性、低背景信号以及飞摩尔级的检测灵敏度，这种双重识别扩增策略在卵巢癌的早期临床诊断、术后监测，以及复杂生物样本中环状RNA生物标志物的液体活检检测方面具有巨大的应用潜力。

章节要点

试剂与材料

本研究使用的所有寡核苷酸（见表S1），包括crRNA、环形探针、捕获探针“5”以及荧光报告探针（FQ探针），均由上海桑根生物科技有限公司合成并纯化。而合成的目标环状RNA hsa_circ_0007534及其变异体（s-circ、d-circ、t-circ），以及同源环状RNA（circ-1、circ-2），则由北京晶科生物技术有限公司合成。重组型dCas13a蛋白和Cas12a（Cpf1）则由

双重识别平台的工作机制

所设计的双重识别平台的工作原理如图1所示。在该设计中，dCas13a/crRNA首先通过His标签与磁珠结合，从而形成dCas13a/crRNA@MBs复合体，该复合体能够以极高的亲和力和特异性识别并捕获目标环状RNA的BSJ区域（标记为“1”）。与传统寡核苷酸探针不同，dCas13a/crRNA复合体既具备可编程的识别功能，又具有物理锁定的作用

结论

总之，我们成功构建了一种双重锁定的荧光级联检测平台，该平台将dCas13a/crRNA的识别功能与DSN介导的切割功能相结合，从而实现了对卵巢癌相关环状RNA的高灵敏度、高特异性检测。这一策略的创新之处在于采用了正交的双重识别架构：该检测方法不需要依赖单一的靶向机制，而是要求dCas13a/crRNA同时与环状RNA的背剪接连接区域结合，同时还需要DSN的参与来实现切割作用

CRediT作者贡献说明

周东梅：写作——审阅与编辑、项目管理、方法设计、实验研究、资金获取、概念构思。江逸楠：写作——初稿撰写、数据可视化、实验研究、概念构思。刘岩：写作——初稿撰写、方法设计、实验研究、概念构思。梁佩丽：实验研究、数据正式分析。张玉萍：软件应用、方法设计。邹海娇：软件应用、实验资源准备。李建奇：实验资源准备、实验研究。

经费来源声明

本研究得到了以下项目的资助：广东省医学科技研究计划（编号A2023337）；广州市科技计划项目（编号2024A03J0182和2023A03J0375）；西藏自治区自然科学基金（编号XZZR202402076(W)）。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

无。

Dongmei Zhou|Yinan Jiang|Yan Liu|Peili Liang|Yuping Zhang|Haijiao Zou|Jianqi Li