市售抗体对内源性小鼠TRAF1（Tumor necrosis factor receptor?associated factor 1）在分离的免疫细胞中的检测灵敏度有限

《Molecular and Cellular Probes》：Limited sensitivity of commercially available antibodies for endogenous mouse TRAF1 detection in isolated immune cells

　　

TRAF1是一种NF?κB（Nuclear factor kappa?light?chain?enhancer of activated B cells）诱导的信号适配蛋白，可调控免疫反应。在单核细胞和巨噬细胞中，其限制Toll样受体（Toll?like receptor, TLR）下游的NF?κB和MAPK（Mitogen?activated protein kinase）通路；而在T和B淋巴细胞中，其分别通过4?1BB和CD40下游促进细胞存活。这种多面性角色需要对TRAF1表达及其与信号伙伴的相互作用进行遗传和药理学操控，此类研究的关键在于可获得可靠且特异的能检测TRAF1蛋白表达的抗体。研究人员在此以野生型（Wild?type, WT）和Traf1敲除（Knockout, KO）细胞作为确定对照，系统评估了四种不同的市售TRAF1抗体克隆（1F3、H3、E12和45D3）。研究人员证实，经LPS（Lipopolysaccharide）、Pam3CSK4或Resiquimod刺激后，野生型骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow derived macrophages, BMDMs）中Traf1 mRNA显著诱导，且经CD3或CD3 + CD28共刺激激活T细胞后亦如此。尽管如此，克隆1F3和45D3在阴性对照裂解物中产生非特异性信号；而克隆E12和H3仅在HEK293FT细胞过表达时可检测小鼠TRAF1，即使在刻意过载裂解物或通过免疫沉淀富集的情况下，也无法在分离的BMDMs或T细胞中检测到内源性TRAF1。值得注意的是，克隆H3可在抗?CD3或抗?CD3联合LPS激活的总脾细胞裂解物中重复检测到TRAF1，表明检测本身可行，且在存在高表达亚群的混合细胞群中可能实现检测。这些发现揭示了一个关键的灵敏度缺口：目前可用的市售抗体不足以测量分离的单核细胞/巨噬细胞或T细胞中的内源性TRAF1，而这些细胞类型正是与炎症驱动及自身免疫疾病最相关的类型，并强调需要新的、经过严格验证的试剂来支持小鼠模型中TRAF1生物学的细胞类型特异性研究。

研究背景方面，肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumor necrosis factor receptor?associated factors, TRAFs）是协调多种免疫受体下游信号的胞内适配蛋白。其中TRAF1在结构上缺乏其他TRAFs具有的N端RING结构域，仅限在受体近端信号复合物中起支架作用。功能上TRAF1具有分化和细胞类型特异性：在单核细胞和巨噬细胞中限制TLR下游炎症信号，在淋巴细胞中则通过TNF受体超家族成员支持存活与活化。既往多项研究利用Traf1^-/-小鼠解析TRAF1在体内生物学，但其内源性蛋白的可靠检测始终是技术难题。早期使用的多克隆试剂如N19、H123现已停产，目前研究者只能依赖少数单克隆市售抗体（1F3、45D3、E12、H3），这些抗体尚未利用遗传敲除对照系统验证其对生理水平小鼠TRAF1的特异性和灵敏度。若无良好验证的试剂，难以确认内源性TRAF1表达、评估基因或药物操作在蛋白层面的效率，或解释条件性敲除模型中的细胞表型。因此，研究人员利用WT和Traf1^-/-细胞作为确定对照，在《Molecular and Cellular Probes》发表该研究，系统评估四种市售TRAF1抗体克隆在免疫印迹中对小鼠内源性TRAF1的检测能力，明确其灵敏度和特异性局限，指出当前试剂在分离免疫细胞检测中的缺口及对新试剂的需求。

为开展研究，关键技术与样本来源包括：使用C57BL/6N小鼠和Traf1^-/-小鼠（由Tsitsikov等报道构建）来源的初级细胞；制备野生型和Traf1^-/-骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）、脾CD3⁺ T细胞、总脾细胞；使用HEK293FT细胞进行小鼠TRAF1?FLAG过表达及空载体对照；通过RT?qPCR检测Traf1 mRNA表达并以Rplp0为内参；采用Western blotting在变性条件下以四种TRAF1抗体克隆检测蛋白，并以β?肌动蛋白（β?actin）为上样对照、磷酸化NF?κB p65（phospho?NF?κB p65 (Ser536)）为活化对照；通过免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）用H3克隆富集BMDM中TRAF1再以同克隆检测；通过流式细胞术CFSE增殖实验验证T细胞活化；统计学采用双向ANOVA与?ídák多重比较。

研究结果如下：

Traf1 mRNA在WT而非Traf1^-/- BMDMs中被多种TLR激动剂诱导。研究人员以RT?qPCR检测经LPS、Pam3CSK4或Resiquimod刺激的WT与Traf1^-/- BMDMs中Traf1 mRNA，发现WT中呈时间依赖性增加，Traf1^-/-中未检测到表达，基因型经PCR验证正确，确认诱导特异性与遗传删除有效性。

市售抗体无法在初级BMDMs中检测内源性TRAF1。研究人员以四种克隆对HEK293FT过表达及BMDM刺激裂解物进行Western blotting，发现1F3和45D3在空载体对照中也出现约49 kDa条带，显示非特异性；E12和H3仅在过表达时特异识别TRAF1?FLAG，但在LPS刺激达24小时的WT BMDMs中均未检出内源性TRAF1。即使刻意过载BMDM裂解物（100 μg）并同时低载过表达阳性对照（15 μg），H3仍仅在后者检出，且在Pam3CSK4、Resiquimod各时间点及磷酸化p65确认活化的条件下亦然；添加过表达裂解物到BMDM裂解物的加标对照可被检出，证明流程本身可行，失败源于抗体对孤立细胞中外源性水平TRAF1灵敏度不足；免疫沉淀富集后仍用轻链特异二抗排除IgG重链干扰，未在BMDM中检出TRAF1。

免疫沉淀未能改善BMDMs内源性TRAF1检测。研究人员以H3克隆对LPS刺激4 h或24 h的WT和Traf1^-/- BMDM裂解物进行IP后再以H3免疫印迹，使用重链＋轻链二抗时在约50 kDa处见条带，但该条带为IgG重链共迁移；换用轻链特异二抗后重链条带消失，WT和Traf1^-/-样品均无TRAF1信号，Ponceau S染色确认IP洗脱物上样相当，表明即便抗体富集仍无法在孤立BMDM中检出内源性TRAF1。

市售抗体无法在活化的初级T细胞中检测内源性TRAF1。研究人员分离纯度＞90%脾CD3⁺ T细胞，以板结合抗?CD3或抗?CD3加抗?CD28刺激1、6、24 h，磷酸化p65确认NF?κB活化，72 h CFSE稀释确认增殖，但H3在任何时间点WT T细胞中均未检出内源性TRAF1，而过表达阳性对照在同一膜上清晰可见；遮蔽对照与负载泳道的长曝光亦未发现基因型依赖信号，说明灵敏度缺口跨髓系与淋巴系孤立细胞存在。

内源性TRAF1在活化的总脾细胞中可被检出。研究人员以抗?CD3或抗?CD3加LPS刺激WT和Traf1^-/-总脾细胞0、1、6、24 h后裂解并Western blotting，H3在WT中随时间出现清晰约49 kDa TRAF1信号，24 h强度接近过表达阳性对照，Traf1^-/-中无信号，证实在混合脾细胞群中当总TRAF1丰度足够时H3可检测内源性蛋白，孤立细胞制备中失败源于试剂灵敏度而非方法本身。

讨论部分总结：研究人员指出TRAF1在免疫调节中具有环境依赖性作用，遗传研究证明其限制单核/巨噬细胞炎症、支持淋巴细胞存活，其表达降低变异与炎症病风险相关，故准确测量蛋白至关重要。本研究以WT和KO为对照系统评估四克隆，1F3和45D3出现阴性对照非特异性信号；E12和H3在过表达中特异，但在三种TLR刺激BMDMs及T细胞活化中均无法检内源性TRAF1，符合mRNA诱导、磷酸化p65活化、过载/低载、加标、脾细胞阳性等多证据指向抗体灵敏度限制而非蛋白缺席或方法失效。快速降解不太可能单独解释，因mRNA持续诱导且既往半衰期＞6 h，脾细胞急性活化可积累至可检水平。培养环境缺失体内协同信号可能导致孤立细胞蛋白水平降低，但无论机制为技术灵敏度或生物学丰度下降，当前市售试剂均不足以测孤立单核/巨噬及T细胞内源性TRAF1。既往报道多用已停产多克隆抗体现有单克隆未以KO对照验证，部分所用克隆（如45D3）本研究发现非特异性，且许多研究缺KO对照致信号难辨真假。脾细胞可检而孤立细胞不可检可能源于高表达亚群（如活化B细胞通过CD40上调TRAF1）或总蛋白量差异，这对条件性敲除研究具有重要意义。本研究限于变性凝胶检测，未评估IHC、IF、流式等；仅测单批次克隆；未用靶向质谱等正交方法；IP未平行同型对照；未全面体内组织普查。结论为：四种最广用市售TRAF1克隆在生理激活下缺乏足够特异性（1F3、45D3）或灵敏度（E12、H3）以可靠检测孤立单核/巨噬细胞或T细胞内源性小鼠TRAF1，虽H3可在活化总脾细胞检出，这构成领域方法学缺口，需以Traf1^-/-对照严格验证的新试剂，以在炎症与自身免疫的细胞类型特异模型中实现TRAF1蛋白层面确认。