尿液蛋白质组学将ADAMDEC1鉴定为不稳定颈动脉粥样硬化斑块的非侵入性生物标志物

《Molecular & Cellular Proteomics》：Urinary Proteomics Identifies ADAMDEC1 as a Non-Invasive Biomarker of Unstable Carotid Atherosclerotic Plaques

　　

背景：易损颈动脉粥样硬化斑块（carotid atherosclerotic plaques, CAPs）的破裂是缺血性卒中的主要诱发原因。当前基于影像学的风险分层有助于解剖和结构评估，但不能轻易提供斑块相关分子信息的非侵入性获取。在此，研究人员旨在鉴定并验证一种非侵入性的尿液生物标志物用于CAP不稳定性，并探索其生物学相关性。方法：研究人员采用多阶段研究设计，在由179例患者组成的发现队列中进行非靶向尿液蛋白质组学分析（数据非依赖采集质谱，DIA-MS），并系统性地查询斑块组织蛋白质组学和转录组学数据集。候选蛋白随后在由225例个体组成的独立队列中通过酶联免疫吸附试验（ELISA）进行进一步评估，这些个体包括稳定或不稳定CAP患者以及健康对照。细胞和组织水平分析包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）再分析、通过免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹（Western blotting）和免疫荧光（IF）进行的人斑块验证，以及体外巨噬细胞表型分析。结果：尿液蛋白质组学分析鉴定出227种与斑块不稳定性相关的共享差异蛋白。在独立验证队列中，尿液ADAMDEC1被确认为候选尿液标志物，显示出从健康对照到稳定CAP再到不稳定CAP的逐步升高。尿液ADAMDEC1对不稳定斑块具有稳健的区分能力（受试者工作特征曲线下面积AUC = 0.882，95%置信区间CI 0.822–0.941）。较高的尿液ADAMDEC1水平与症状状态和斑块易损性特征相关，而较高的斑块内ADAMDEC1表达与不良脑血管结局相关。单细胞和人斑块分析显示，ADAMDEC1在炎症性巨噬细胞相关斑块区域富集，体外实验支持ADAMDEC1与促炎性巨噬细胞极化之间的关联。结论：尿液ADAMDEC1是一种与颈动脉斑块不稳定性相关的非侵入性生物标志物。整合的组织、单细胞和巨噬细胞实验支持ADAMDEC1与易损斑块中巨噬细胞相关炎症特征之间的关联。

**论文解读**

**研究背景与科学问题**
颈动脉粥样硬化斑块的不稳定性是缺血性卒中的主要诱发因素。传统上，管腔狭窄程度被用于指导临床决策，但越来越多的证据表明，斑块组成、炎症活性和生物学易损性——而非单纯狭窄严重度——关键性地影响斑块破裂和下游栓塞事件的风险。因此，在临床事件发生前改进不稳定颈动脉斑块的识别，仍是血管医学实践中的核心且未解决的挑战。当前评估斑块不稳定性的方法主要依赖影像学手段（如超声、CT血管造影、磁共振成像），这些技术虽提供有价值的形态学信息，但难以捕捉斑块内动态生物学过程，如炎症激活、细胞外基质重塑和免疫细胞浸润。基于血液的生物标志物（如C反应蛋白、基质金属蛋白酶）受限于斑块水平特异性不足和系统性混杂因素。尿液作为非侵入性生物体液，具有高度稳定、不受严格稳态调控的特点，有利于积累反映系统性炎症和组织重塑的敏感标志物。基于质谱的蛋白质组学，特别是数据非依赖采集（DIA-MS）技术，已能实现尿液蛋白质组的深度、可重复和定量分析，但尿液蛋白质组学是否能捕获与颈动脉斑块不稳定性相关的分子特征尚待探索。

**研究内容与主要结论**
本研究通过多阶段尿液蛋白质组学策略，鉴定并验证了与颈动脉斑块不稳定性相关的生物标志物。研究人员首先在179例颈动脉内膜切除术患者的发现队列中，采用DIA-MS进行无偏发现性分析，并在独立队列（225例个体，包括稳定CAP、不稳定CAP和健康对照）中通过ELISA进行验证。通过整合尿蛋白质组与斑块组织蛋白质组、转录组、单细胞和组织学数据，研究人员确定了ADAMDEC1（ADAM样降糖蛋白1）作为候选非侵入性生物标志物。尿液ADAMDEC1在验证队列中从健康对照至稳定CAP至不稳定CAP呈逐步升高，区分不稳定斑块的AUC达0.882（95% CI 0.822–0.941）。斑块内ADAMDEC1高表达与不良脑血管事件相关。单细胞及组织分析显示ADAMDEC1在炎症性巨噬细胞亚群中富集，体外实验表明ADAMDEC1与促炎性M1型巨噬细胞极化相关。该研究发表于《Molecular》。

**主要关键技术方法**
研究采用多阶段设计。发现队列来源于吉林大学第一医院，包含179例患者，尿液样本经DIA-MS分析。独立验证队列包含225例个体（85例健康对照、57例稳定CAP、83例不稳定CAP），尿液候选蛋白通过ELISA定量。利用6个已发表CAP蛋白质组数据集和2个转录组数据集（GSE43292、GSE28829）进行交叉验证，预后分析基于GSE21545数据（126例患者）。单细胞RNA测序再分析使用GSE159677数据集（含动脉粥样硬化核心AC和近端邻近PA组织）。人斑块验证通过免疫组化、蛋白质印迹和免疫荧光，细胞实验采用THP-1来源巨噬细胞进行基因沉默和重组蛋白处理，流式细胞术评估M1/M2极化。

**研究结果**

**尿液蛋白质组学分析鉴定与颈动脉斑块不稳定性相关的特征**
通过DIA-MS分析发现队列，主成分分析显示稳定与不稳定CAP在训练集和内部验证集中分离。差异表达分析共鉴定出230种共享差异蛋白（227种方向一致）。KEGG和GO富集分析揭示这些蛋白涉及细胞外基质组织、炎症与先天免疫应答、抗原加工呈递、中性粒细胞脱颗粒、内吞等与斑块失稳相关的生物学过程，表明尿液蛋白质组能捕获疾病相关分子特征。

**跨组学优先级排序与独立验证将ADAMDEC1鉴定为不稳定颈动脉斑块的尿液生物标志物**
将尿液差异蛋白与6个已发表斑块蛋白质组数据集交叉比对，发现ADAMDEC1和PRKAR1A在多个独立数据集中重复出现。在两个外部转录组数据集（GSE28829、GSE43292）中，ADAMDEC1在斑块中上调，PRKAR1A下调。在225例独立验证队列中，ELISA证实尿液ADAMDEC1从健康对照至稳定CAP至不稳定CAP呈逐步升高，而PRKAR1A在稳定CAP与健康对照间无差异。尿液ADAMDEC1区分不稳定斑块的AUC为0.882，校正混杂因素后仍显著。斑块内ADAMDEC1高表达与更差的脑血管事件无事件生存率相关（GSE21545数据）。

**尿液ADAMDEC1水平与斑块易损性及临床表型相关**
将验证队列患者按尿液ADAMDEC1三分位数分层，高ADAMDEC1组中不稳定斑块比例、症状状态比例、斑块内出血严重程度均显著增加，而钙化程度呈轻度为主。尿液ADAMDEC1与常规心血管风险因素（年龄、性别、BMI、吸烟、高血压、糖尿病、血脂）无显著相关性，提示其与斑块易损性的关联独立于传统风险因素。

**ADAMDEC1在晚期颈动脉斑块的炎症性巨噬细胞中富集**
单细胞RNA测序再分析（GSE159677）显示，ADAMDEC1表达主要限于巨噬细胞群，且在动脉粥样硬化核心（AC）巨噬细胞中表达显著高于近端邻近（PA）组织。进一步亚聚类将巨噬细胞分为炎症性和非炎症性亚群，ADAMDEC1优先在炎症性巨噬细胞中富集，尤其AC炎症性亚群。ADAMDEC1表达与促炎基因CCL3、CD86、HLA-DRA、CCL4呈正相关。

**人斑块验证与体外实验支持ADAMDEC1与促炎性巨噬细胞活化之间的关联**
免疫组化显示ADAMDEC1在AC区域染色强于PA，蛋白质印迹验证蛋白丰度升高。免疫荧光共定位显示ADAMDEC1与CD68和CD86阳性巨噬细胞共标。在THP-1来源巨噬细胞中，重组ADAMDEC1处理增加M1样细胞比例，而ADAMDEC1沉默减弱脂多糖诱导的M1极化，流式细胞术和免疫荧光均证实这些效应。

**讨论与结论**
本研究通过整合尿液蛋白质组学、斑块组织多组学、单细胞和细胞实验，发现尿液ADAMDEC1是一种与颈动脉斑块不稳定性相关的可重复、非侵入性生物标志物。尿液ADAMDEC1水平在独立队列中稳健区分不稳定斑块，且与斑块炎症性巨噬细胞特征相关。研究结论：总之，本研究将尿液ADAMDEC1鉴定为一种可重复的、与颈动脉斑块不稳定性相关的非侵入性生物标志物。通过整合尿液蛋白质组学与人斑块转录组学、单细胞、组织水平和巨噬细胞实验数据，研究人员提供了将尿液ADAMDEC1与易损斑块中巨噬细胞相关炎症特征联系起来的证据框架。这些发现为评估尿液ADAMDEC1作为现有临床和斑块评估的补充提供了依据，并为未来纵向和机制性研究奠定了基础。