原发性开角型青光眼早期与晚期蛋白质组学分析揭示与疾病分期相关的生物化学特征

《Molecular & Cellular Proteomics》：Proteomic Analyses of Early Versus Advanced Primary Open Angle Glaucoma Uncover Biochemical Signatures Associated with Disease Staging

　　

原发性开角型青光眼（POAG）是导致失明的主要原因，然而疾病进展背后的生化机制仍知之甚少。本研究利用大规模蛋白质组学表征了早晚期POAG的房水（AH）。在这项前瞻性横断面研究中，研究人员从轻度POAG、晚期POAG和非青光眼对照组患者中收集了AH样本。使用抗体阵列对8000种蛋白质进行了分析。进行了层次聚类、主成分分析（PCA）、基因本体论（GO）和通路富集分析，以识别与疾病分期相关的差异表达蛋白、生物学过程和分子功能。顶级差异蛋白还与关键临床参数进行了关联。蛋白质组学特征显示对照组和青光眼患者之间存在明显的聚类，并从轻度到晚期阶段逐渐变化。对照组与各青光眼组之间的比较揭示了与伤口愈合、细胞外基质（ECM）重塑和免疫反应相关的通路显著富集。值得注意的是，在比较轻度与晚期POAG阶段时，独特的促炎和免疫蛋白及通路被富集。最后，顶级差异AH蛋白与多个临床终点相关，包括眼内压和各种视网膜结果。该特征揭示了一个与疾病分期紧密相关的网络，聚焦于免疫细胞迁移和功能，并鉴定可溶性TRPC₆为一种新型生物标志物。据研究人员所知，这是首次比较不同疾病阶段POAG患者AH的大规模蛋白质组学研究，提示了青光眼进展的新机制。

**研究背景与问题**
青光眼是全球致盲的主要原因，其中原发性开角型青光眼（POAG）最为常见，其病理机制涉及眼压（IOP）依赖性和非依赖性因素，但疾病进展的生化机制尚不明确。既往研究多聚焦于单一疾病阶段（通常为晚期），且仅针对有限数量的细胞因子或趋化因子进行靶向多重分析，缺乏对总蛋白质组的大规模、无偏探究。因此，不同疾病阶段（从早期到晚期）POAG的差异性蛋白质组特征存在显著知识空白。本研究旨在通过大规模蛋白质组学分析，比较轻度与晚期POAG患者房水（AH）的蛋白质谱，揭示与疾病分期相关的生化特征及关键蛋白和通路的变化。论文发表在《Molecular》。

**主要技术方法**
本研究采用前瞻性横断面设计，从多伦多西部医院和Kensington眼科研究所招募患者，包括非青光眼对照组、轻度POAG组和晚期POAG组（各10例，最终调整后分别为10、8、12例）。主要技术方法包括：使用RayBiotech Human L-8000抗体阵列对8000种蛋白质进行定量蛋白质组分析；通过层次聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA）评估数据质量与分组分离；应用基因本体论（GO）富集分析（clusterProfiler）和pathDIP通路富集分析（整合12个主要通路数据库）识别差异表达蛋白、生物学过程（BP）、分子功能（MF）及细胞组分（CC）；采用Pearson相关性分析将顶级差异蛋白与5个关键临床参数（杯盘比CDR、术前IOP、平均偏差MD、视网膜神经纤维层RNFL厚度、神经节细胞复合体GCC厚度）进行关联。

**研究结果**
1. **患者人口统计学与临床数据匹配**：三组患者在年龄、性别、眼别、种族/民族方面无显著差异，但轻度组（MG）和晚期组（AG）的眼压（IOP）、杯盘比（CDR）、平均偏差（MD）及视网膜厚度（RNFL、GCC）与对照组（Control）相比均呈现显著进行性恶化（P<0.05）。
2. **初始蛋白质组数据分析**：PCA显示对照组与青光眼样本沿PC1明显分离，而MG与AG沿PC2有细微差异；HCA表明前500个变异最大的蛋白质在三组间形成不同聚类。共鉴定出差异蛋白：MG vs Control 990个，AG vs Control 2674个，AG vs MG 828个（阈值log2 fold change >0.25或<-0.25，–log10(p-value)>1.2）。
3. **不同阶段间顶级差异蛋白鉴定**：各比较组的顶级差异蛋白（按fold change排序）高度特异，组间重叠极少。例如，MG vs Control中LPS、CD45、Gas1、TRPC₆等显著上调；AG vs Control中PSP、Tec、MINA等上调，而ALBUMIN、Thrombomodulin下调；AG vs MG中HDDC3、DKK2、DEK等上调，Fractalkine、IL-20等亦上调。
4. **基因本体论与通路富集分析**：Control vs MG和Control vs AG的GO分析均富集于伤口愈合、ECM重塑和适应性免疫反应（如“伤口愈合”、“肽酶抑制剂活性”、“白细胞迁移”）。而MG vs AG的GO分析独特地富集于促炎反应和信号通路，包括“细胞表面受体调节/激活”、“趋化性”、“白细胞迁移”、“细胞因子受体结合”等。pathDIP通路分析进一步显示：MG vs Control富集于结构重塑和伤口愈合（如黏着斑、VEGFA-VEGFR2信号）；AG vs MG转向炎症和免疫激活（如IL-4/13、补体、吞噬体通路）；AG vs Control则显示全局免疫、结构和代谢失调（如白介素信号、ECM组织、细胞因子-受体相互作用）。
5. **差异蛋白特征与临床参数的相关性**：从三组比较中提取56个独特差异蛋白，与5个临床参数（CDR、术前IOP、MD、RNFL厚度、GCC厚度）进行Pearson相关分析，结果显示显著相关性，其中CDR和术前IOP相关蛋白最多（分别为46和45个）。GO分析显示这些相关蛋白显著富集于免疫细胞迁移（BP）和激酶/内肽酶活性（MF）。STRING互作分析揭示该特征蛋白构成紧密的细胞信号网络。
6. **TRPC₆作为新型生物标志物的鉴定**：在所有12个与全部5个临床参数均显著相关的候选蛋白中，TRPC₆的差异最显著，且随疾病分期逐步升高。其他TRPC家族成员中，TRPC₁呈类似升高，但TRPC₄AP和TRPC₅无变化。人眼组织免疫染色显示TRPC₆在视网膜神经节细胞（RGCs）中富集，并在虹膜上皮、小梁网（TM）和睫状肌中也有表达，提示其可能来源于前房或视网膜。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究是迄今为止最大规模比较不同阶段POAG患者AH蛋白质组的研究，首次揭示了轻度与晚期疾病之间的显著差异。与其他研究相比，本数据明确区分了对照组与轻度青光眼，且AH蛋白特征与视网膜神经退行性指标（如CDR、RNFL）和功能视力丧失（MD）密切相关，提示AH生物标志物可能反映神经疾病过程而非单纯眼压升高。通路分析支持青光眼进展是一个累积性系统级过程，涉及伤口愈合、ECM重塑、适应性免疫及炎症的“免疫开关”。研究结论翻译如下：
综上所述，本研究对来自不同阶段POAG患者房水的大规模蛋白质组学分析，为疾病发生和进展相关的生化改变提供了新见解。通过扩大分析范围至靶向细胞因子或趋化因子之外，我们鉴定了关键通路——特别是与伤口愈合、细胞外基质重塑、适应性免疫和炎症相关的通路——并发现了新型生物标志物。这些通路与POAG病理生理学和分期密切相关。我们的发现为未来的纵向和机制研究奠定了重要基础，最终将有助于发现旨在阻止或延缓青光眼进展的新型生物标志物和治疗靶点。