MELAS患者一氧化氮缺乏症的L-瓜氨酸治疗：一项I期剂量探索与安全性研究

《Molecular Genetics and Metabolism》：L-citrulline treatment of nitric oxide deficiency in MELAS a phase I dose-finding and safety study

　　摘要：有证据表明，线粒体脑病、乳酸酸中毒及卒中样发作（MELAS）患者存在一氧化氮缺乏，这可能导致小血管的血液灌注受损，进而引发卒中样发作。本项I期研究的主要目的是确定MELAS患者可耐受的L-瓜氨酸最大剂量。主要安全性指标为治疗开始后八周内是否出现剂量限制性毒性。次要指标包括从基线到治疗结束（第四周）的脑血流量、脑血管反应性以及瓜氨酸、精氨酸和鸟氨酸水平的变化。第一周检测了血浆胍类化合物，以评估潜在的精氨酸毒性，同时检测了从基线到治疗结束的血浆乳酸和丙氨酸水平，作为药效学生物标志物。共筛选了10名连续患者并分配不同剂量：10克（n=1）、20克（n=1）、30克（n=2）和40克（n=6）。所有剂量组均未出现剂量限制性毒性。不过，在较高剂量的L-瓜氨酸组（30克和40克）中，血浆胍类化合物检测出现异常值（Z值>2）。7名研究对象的脑血流量较基线有所增加，其中6人处于最高剂量组，且增加最显著的区域为枕叶。在最高剂量组，第四周时血浆精氨酸和瓜氨酸水平较基线显著上升。尽管未观察到剂量限制性毒性，但30克和40克剂量组的胍类化合物升高现象需通过后续系列检测进一步研究，以确认这些剂量的安全性并判断其效应是否可持续。未来还需要开展随机安慰剂对照试验，以评估L-瓜氨酸对MELAS患者的疗效。

引言：线粒体脑病、乳酸酸中毒及卒中样发作（MELAS；MIM编号540000）是最常见的母系遗传性线粒体疾病之一，患病率约为1/6000。北美线粒体疾病联盟的一项多中心横断面研究显示，MELAS是第二常见的线粒体疾病，在经分子诊断确诊的参与者中占比达11%。MELAS由线粒体DNA中的致病突变引起，最常见的致病突变是编码tRNALeu/(UUR)的MT-TL1基因的m.3243 A>G突变。该病为多系统疾病，主要表现为卒中样发作、乳酸酸中毒、运动不耐受、癫痫以及红色纤维异常。其他症状还包括反复头痛、痴呆、感音神经性听力损失、生长迟缓、糖尿病、心肌病、肾脏疾病以及胃肠道功能障碍。由于MELAS相关的线粒体DNA致病突变以杂合状态存在，患者病情严重程度差异较大，发病年龄也各不相同。75%的患者在20岁之前发病，通常在儿童期发病。

MELAS的多器官受累病理机制较为复杂。m.3243 A>G突变会导致线粒体蛋白质合成受损，进而影响线粒体电子传递链的合成，最终导致能量产生不足。此外，氧化应激会通过激活转录因子NFkB，促进miRNAs尤其是miR-9/9*的表达。这些miRNAs会负向调控关键的线粒体tRNA修饰酶GTPBP3、MTO1和TRMU，导致线粒体tRNA修饰不足，进一步影响线粒体翻译功能，加剧MELAS的临床表现。近十年来，越来越多的证据表明MELAS患者可能存在一氧化氮缺乏，而这可能参与了多种疾病相关并发症的形成。大脑微血管中的一氧化氮缺乏被认为与MELAS中的卒中样发作机制有关。实际上，单光子发射计算机断层扫描研究发现，卒中样发作早期受累区域存在灌注不足，提示内皮功能异常。MELAS患者在卒中样发作期间的血浆硝酸盐和亚硝酸盐浓度低于正常人。通过稳定同位素灌注技术检测发现，MELAS患者无论成人还是儿童，其体内一氧化氮生成量均低于正常人。

一氧化氮是由一氧化氮合酶催化生成的，该酶以精氨酸为底物产生一氧化氮，瓜氨酸则为反应的副产物。由于精氨酸本身是由瓜氨酸经过精氨琥珀酸合成酶1和精氨琥珀酸裂解酶的依次作用生成的，因此精氨酸和瓜氨酸都是一氧化氮合成的前体。一氧化氮在维持小血管通畅所必需的血管平滑肌松弛过程中起着关键作用。MELAS患者一氧化氮合成受阻的潜在原因之一是其前体物质——精氨酸和瓜氨酸的缺乏。事实上，MELAS患者的血浆精氨酸和瓜氨酸水平均低于正常人。MELAS患者的精氨酸清除率较高，这可能是其水平较低的原因之一。此外，MELAS患者的从头合成精氨酸能力也低于健康人。这一现象可归因于MELAS及其他线粒体疾病中普遍存在的瓜氨酸水平降低，从而导致从头合成精氨酸的能力下降。一项整合蛋白质组学和代谢组学的研究发现，精氨酸生物合成途径可能因精氨琥珀酸合成酶1通路受阻而下调。此外，NOS活性降低也可能导致MELAS患者一氧化氮合成障碍。在携带m.3243 A>G突变的线粒体胞质杂交体中，亚硝酸盐和硝酸盐浓度较低，说明NOS活性下降。在不同线粒体疾病患者的肌肉纤维中，细胞色素c氧化酶阴性纤维的NOS活性也较低。MELAS患者体内不对称二甲基精氨酸和活性氧水平升高，也可能导致NOS活性受损。此外，一氧化氮生成后还可能因在COX阳性部位被COX结合或被用于生成活性氧而被截留。

鉴于一氧化氮缺乏在MELAS中的作用，有观点认为给予一氧化氮前体物质可能对该病具有治疗意义，尤其是在改善卒中样发作方面。2002年，Koga等人发现，在MELAS患者的卒中样发作急性期给予L-精氨酸，可改善三例患者的微循环状况及症状。一项纳入24名MELAS患者的更大规模试验表明，卒中样发作后给予L-精氨酸可带来临床和生化指标的改善。在发作间歇期口服L-精氨酸也可降低卒中样发作的频率和严重程度。先前的研究显示，给MELAS患儿和成人服用L-精氨酸和L-瓜氨酸可增加一氧化氮的生成。10名MELAS成人患者接受每平方米体表面积10克的L-精氨酸治疗48小时后，其精氨酸向瓜氨酸的转化率上升，表明一氧化氮生成增加。有趣的是，相同剂量下的L-瓜氨酸补充能进一步增加从头合成精氨酸的量，进而提升一氧化氮生成水平，这说明相比L-精氨酸，L-瓜氨酸是一氧化氮更优的前体。在MELAS患儿中也有类似结果。L-瓜氨酸比L-精氨酸更适合作为一氧化氮前体的原因可能包括：肠道中的精氨酸酶II会分解摄入的精氨酸，从而使瓜氨酸的口服生物利用度更高；瓜氨酸无需经历首过效应；此外，精氨酸在肝脏中可通过精氨酸酶I转化为鸟氨酸。还有研究认为，L-瓜氨酸能更有效地增加细胞内精氨酸含量，因为精氨酸酶I会在尿素循环中分解细胞内精氨酸，同时阳离子氨基酸转运体会调控细胞外精氨酸的运输。瓜氨酸可通过精氨琥珀酸合成酶1和精氨琥珀酸裂解酶转化为精氨酸，这两种酶与NOS位于同一位置，且已被证实会与诱导型NOS共同表达。虽然L-瓜氨酸补充后血浆精氨酸水平略高于L-精氨酸补充后的水平（分别为3倍和2.5倍），但其对从头合成精氨酸速率的提升作用更为显著（分别为10倍和1.3倍）。通过L-瓜氨酸补充提高一氧化氮水平，有望改善所有微血管区域的血液灌注。因此，L-瓜氨酸的益处不仅限于改善卒中样发作，还可能改善MELAS的其他临床表现，如肌肉无力、运动不耐受、糖尿病和乳酸酸中毒。实际上，L-瓜氨酸补充后血浆乳酸水平显著下降，而L-精氨酸补充则未达到统计学上的显著差异。尽管一氧化氮生成增加和微血管灌注改善可能有助于这一效应，但MELAS患者的高乳酸血症是多因素引起的，主要与氧化磷酸化功能受损及由此导致的代谢紊乱有关。因此，L-瓜氨酸补充后血浆乳酸水平下降不能仅归因于微血管功能改善，其具体机制仍有待进一步研究。

目前关于一氧化氮前体物质在MELAS综合征中作用的临床研究十分有限。尽管L-瓜氨酸被用于治疗近端尿素循环障碍，但在MELAS中的应用中，其安全的长期剂量尚未确定。因此，本研究开展了一项I期剂量探索试验，旨在确定MELAS患者可耐受的L-瓜氨酸最大剂量，并评估其安全性。（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03952234）

研究参与者：参与者在美国德克萨斯州休斯顿的贝勒医学院进行筛选和入组（NCT03952234）。符合条件者年龄在18至65岁之间，需具备MELAS的临床诊断，在筛选期间（筛选访问前六个月至基线访问期间）的任何时间点血浆乳酸水平均高于2.2毫米摩尔/升，尿妊娠试验呈阴性，蒙特利尔认知评估量表得分在26分及以上。

研究结果：2021年5月至2023年4月期间，共有10名连续参与者完成筛选并入组本研究，无人筛选失败。5名男性和5名女性（年龄范围19–57岁）完成了为期8周的研究。参与者的基本人口学特征见表1，临床特征见补充表1。第一名参与者被分配到2剂量组（10克/天），后续剂量根据TITE-CRM原则逐步上调。

讨论：本研究的主要目的是确定MELAS成人患者可耐受的L-瓜氨酸最大剂量。在本研究中，所有剂量的L-瓜氨酸均未出现剂量限制性毒性，包括最高的40克/天剂量。因此，如果研究计划使用更高剂量，且在未出现剂量限制性毒性的情况下，剂量还可能进一步上调。所有剂量下的L-瓜氨酸均耐受良好，包括最高的每日40克剂量。本研究出现的所有不良事件均为CTCAE 1级或2级。

结论：我们的研究结果表明，每天40克的L-瓜氨酸在MELAS成人患者中耐受性良好，未出现严重不良事件或剂量限制性毒性。然而，由于第一周时血浆胍类化合物水平上升，且该现象可能与神经毒性有关，因此未来研究需谨慎，应考虑使用更低剂量，尤其是在最高剂量下瓜氨酸向精氨酸的肾脏转化可能已达饱和状态。在未来试验中，脑血流量和脑血管反应性可能成为有用的评估指标。

CRediT作者贡献声明：Mohammed Almannai：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、资源获取、项目管理、方法学、研究实施、正式分析、数据整理、概念构建。Jimmy Duong：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、验证、方法学、研究实施、正式分析、数据整理、概念构建。Ayman W. El-Hattab：写作——审阅与编辑、资源获取、方法学、正式分析、数据整理、概念构建。May Ali：项目管理。

资金支持：本研究由美国国立卫生研究院通过北美线粒体疾病联盟（NAMDC）（资助编号U54NS078059–09）、勇气治愈基金会以及Mervar基金会提供资助。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能被视为利益冲突的个人关系或利益关联。Ning Liu和Fernando Scaglia为贝勒基因公司的员工。

致谢：我们非常感谢所有参与研究的患者的奉献与热情。同时，也要感谢联合线粒体疾病基金会（UMDF）和Mito Action为 kami推荐参与者。我们要感谢由Steven Cederbaum医学博士担任主席的数据安全监测委员会，他们对参与者的安全以及研究的进行进行了独立监督。同时，我们也要感谢Morgan Driver博士、MS，CGC以及Robert Rigobello硕士、CGC，他们对遗传与精准医学部门的研究工作进行了严格审查。该部门隶属于沙特阿拉伯利雅得的阿卜杜拉国王医疗城内的阿卜杜拉国王特殊儿童医院，由国家卫队卫生事务部管理。