CXCL3缺乏通过MAPK信号通路抑制香烟烟雾诱导的NETs形成，从而缓解COPD

《Molecular Immunology》：CXCL3 deficiency ameliorates COPD by suppressing cigarette smoke–induced NETs formation via MAPK signaling

　　•香烟烟雾诱发的COPD肺组织中CXCL3的表达显著升高。•敲低CXCL3可抑制香烟烟雾诱导的NETs形成。•CXCL3缺陷可减轻体内的肺部炎症和肺气肿变化。•MAPK信号通路在COPD中介导CXCL3驱动的NETs形成。

引言
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球范围内导致疾病负担和死亡的重要原因。其病理特征为持续的气流受限，这是由于气道逐渐重塑以及肺泡结构破坏所导致的（Agustí等人，2023年）。尽管该病通常需要数十年时间发展，但大多数患者在病情发展到中度或重度之前几乎没有症状或仅有轻微症状，而一旦发展到这些阶段，预后往往较差（Martinez等人，2018年；Lange等人，2021年）。香烟烟雾是COPD最主要的危险因素。它会引发异常的炎症反应，表现为中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞大量进入全身循环和肺部。这些炎性细胞与肺部结构细胞一起释放大量促炎细胞因子，从而导致慢性气道炎症并造成组织损伤（Brightling和Greening，2019年）。值得注意的是，与短期接触香烟烟雾引起的短暂急性炎症不同，COPD患者的气道炎症即使在戒烟后仍会持续存在（Hogg等人，2017年；Oelsner等人，2020年）。这种持续性炎症的机制目前尚不完全清楚，深入理解这一机制对于开发新的治疗方法至关重要。

病毒和细菌引起的呼吸道感染也是COPD的重要诱发因素，因为这些感染会影响下呼吸道并加剧气道炎症（Ritchie和Wedzicha，2020年）。具体而言，铜绿假单胞菌引起的支气管感染会增加COPD患者急性加重的风险及死亡率（Ekl?f等人，2020年）。气道中性粒细胞增多是COPD的典型特征（Lonergan等人，2020年；Moermans等人，2011年），而在病毒引发的加重期间，中性粒细胞的浸润会更加严重（Mallia等人，2011年；Mallia等人，2013年）。中性粒细胞被募集到气道后，可以形成中性粒细胞外陷阱（NETs），这是一种由DNA纤维和嵌入其中的颗粒酶构成的网状结构，能够有效固定并消灭病原体（Papayannopoulos和Zychlinsky，2009年）。越来越多的证据表明，气道中的细菌病原体及其毒素能够激活中性粒细胞的NADPH氧化酶，从而产生过多的活性氧，进而促进NETs的形成。过量的NETs生成会加剧肺部炎症并造成组织损伤（Castanheira和Kubes，2019年）。因此，NETs是COPD气道微环境中的重要组成部分，很可能具有病理意义。不过，它们作为COPD发病机制中的驱动因素的具体作用仍有待进一步阐明。

在本研究中，我们通过香烟烟雾暴露建立了COPD小鼠模型，并通过转录组测序发现肺组织中C-X-C基序趋化因子3（CXCL3）的表达显著升高。CXCL3属于C-X-C趋化因子亚家族，是一种强效的中性粒细胞趋化因子，它能协调白细胞的募集和迁移，从而引发炎症反应（Bao等人，2024年）。通过在体内和体外调节CXCL3的表达，我们发现CXCL3缺陷能够有效抑制香烟烟雾诱导的NETs形成，显著减轻肺部炎症，并改善肺功能。机制研究显示，CXCL3是通过激活MAPK信号通路来推动疾病进展的。总体而言，我们的研究结果表明CXCL3是通过MAPK通路调控NETs形成的关键因子，因此它有望成为治疗COPD的新靶点。

雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄）购自上海SLAC实验动物有限公司（中国上海；证书编号：MCSK2022–0004），这些小鼠被饲养在无特定病原体的设施中，环境温度和湿度受到控制，光照周期为12小时亮光/12小时黑暗，可自由获取标准饲料和水。COPD是通过全身被动吸烟暴露模型来诱导的。含有1.0毫克尼古丁和11毫克焦油的商业香烟在标准化吸烟机中燃烧，产生的主流烟气经过新鲜空气稀释后引入暴露舱。小鼠每天大约要吸入30支香烟的烟气，每天两次，每次暴露75分钟，每周5天，持续12周，其间会有间歇性的恢复期，而对照组小鼠则被置于装有新鲜空气的相同暴露舱中（Chen等人，2024年）。实验结束时，给小鼠腹腔注射1.25%的三溴乙醇（MeilunBio，MA0478），剂量为0.3毫升/10克体重，随后通过颈椎脱位处死小鼠。之后收集肺组织以便进一步分析。

所有动物实验均遵循实验室动物护理和使用指南进行，并获得了皖南医学院第一附属医院动物伦理委员会的批准（批准编号：WNMC-AWE?2023452），以确保所有操作都能将动物的痛苦降到最低，同时符合国际公认的动物福利标准。

肺功能是通过带有气管连接的肺功能检测系统（Buxco PFT Controller，DSI，美国）来评估的。首先用1.25%的三溴乙醇对小鼠进行深度麻醉，然后在气管软骨环上方的小切口处暴露并插管气管。在确保气管与呼吸流量计和压力传感器连接稳固后，记录安静状态下的呼吸数据以确定基础呼吸参数。检测指标包括用力肺活量（FVC）、1秒和2秒时的用力呼气容积（FEV1和FEV2）、FEV1/FVC%、FEV2/FVC%、气道阻力（RL）、肺弹性（RE）以及动态顺应性（Cdyn）。

在实验结束阶段，通过右心室向肺部灌注冷PBS，然后取出肺组织，将其置于4%的多聚甲醛（Beyotime，P0099）中在4摄氏度下固定。经过逐步用乙醇脱水、用二甲苯透明处理以及石蜡包埋后，制作出4微米的切片。对于H&E染色，切片需先脱蜡、复水，然后用苏木精染色，接着在盐酸乙醇中分化处理（Beyotime，C0161），在流动水中漂蓝，再用伊红进行复染，最后脱水、透明处理并使用中性树胶封片（Beyotime，C0185）。对于PAS染色，切片同样经过脱蜡、复水处理，然后依次在暗处与PAS溶液B、A以及C接触，各步骤之间用自来水和蒸馏水冲洗，之后在盐酸中分化处理，用氨水漂蓝，再用伊红复染，最后脱水、透明处理并封片。

我们从对照组小鼠和香烟烟雾诱导的COPD小鼠身上采集肺组织。使用TRIzol试剂（Invitrogen，15596026）提取总RNA，再用NanoPhotometer NP80分光光度计（Implen，德国）检测RNA的质量和含量。样本被储存在-80摄氏度环境中，以备后续使用。

序列文库是使用Illumina TruSeq链状mRNA文库制备试剂盒（Illumina，20020594）制备的，随后在Illumina NovaSeq 6000平台（Illumina，美国）上进行测序，测序读长为150碱基对的双端序列。原始读段通过标准的FASTQ工具过滤，去除低质量序列和接头污染，然后使用HISAT2（v2.2.1）将读段与mm10小鼠基因组比对。通过DESeq2（v1.30.1）分析COPD肺组织与对照组肺组织之间的差异基因表达，筛选标准为|log?FC=?> 1且调整后的p值<0.05。在R语言（v4.2.2）中生成主成分分析图、火山图以及层次聚类热图。免疫相关基因是从ImmPort网站（https://www.immport.org）获取的，然后找出与上调差异基因有重叠的基因。使用clusterProfiler（v4.6.0）进行GO和KEGG富集分析。此外，还使用GSEA软件（v4.2.3）进行基因集富集分析，以找出与CXCL3相关基因相关的通路。

人类COPD肺组织的单细胞RNA测序数据来自GEO数据库，访问号为GSE168191。数据加工和分析是在R语言的Seurat包中完成的。经过质量控制后，数据被标准化，接着进行主成分分析（PCA）和UMAP降维处理。根据典型的标记基因对细胞群进行注释。不同细胞群体中目标基因的表达情况可通过UMAP特征图、点图和小提琴图来展示。

石蜡包埋的肺切片先经脱蜡、复水处理，然后在pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液（Beyotime，P0083）中于95摄氏度下加热20分钟，以实现抗原的释放。接着用0.3%的Triton X?100（Beyotime，ST795）处理切片15分钟，使其通透，然后再用5%的BSA（Sigma-Aldrich，A1933）封闭1小时。将切片在4摄氏度下与抗CXCL3抗体（Bioss，bs?2547R）或抗EPCAM抗体（proteintech，21050–1-AP）共同孵育过夜，之后在室温下于黑暗中用FITC标记的二级抗体处理1小时。细胞核用DAPI（Beyotime，C1002）染色5分钟，最后使用抗褪色介质（Beyotime，P0126）封片。图像是在Zeiss LSM 800共聚焦显微镜下拍摄的，定量分析则是在相同设置下使用ImageJ（v1.53）完成的。

总RNA的提取是按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，15596026）进行的。RNA的质量和含量则通过NanoPhotometer NP80分光光度计（Implen，德国）检测。cDNA的合成则是使用PrimeScript RT试剂盒（Takara，RR047A）完成的。qPCR实验是在QuantStudio 5实时PCR系统中进行的，所用试剂为SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，4309155）。相对mRNA表达量是通过2^-ΔΔCt方法计算得出的，以GAPDH作为内参。引物序列如下：CXCL3-F：5′- CCAAACCGAAGTCATAGCCAC ?3′，CXCL3-R：5′- TGCTCCCCTTGTTCAGTATCT ?3′；GAPDH-F：5′- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT ?3′，GAPDH-R：5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG ?3′。

总蛋白的提取是使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（Beyotime，P0013B）进行的（Beyotime，P1260）。蛋白浓度则是通过BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime，P0012）检测的。等量的蛋白经过SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上（Millipore，IPVH00010）。膜在室温下用5%的无脂牛奶（BD Biosciences）封闭1小时，之后在4摄氏度下与以下一级抗体共同孵育过夜：抗CXCL3抗体（Bioss，bs?2547R，1:1000）、抗CXCR2抗体（Abclonal，a3301，1:1000）、抗JNK抗体（Proteintech，66210–1-Ig，1:5000）、抗磷酸化JNK抗体（Abclone，AP0631，1:3000）、抗ERK抗体（Proteintech，11257–1-AP，1:3000）、抗磷酸化ERK抗体（Proteintech，28733–1-AP，1:2000）、抗p38抗体（Affinity，BF8015，80024–1-RR，1:5000）以及作为加载控制的抗磷酸化p38抗体（Affinity，AF4001，1:1000）。在用TBST洗涤三次后，膜与HRP标记的二级抗体（Absin，abs20040/abs20039）在室温下共同孵育1小时。蛋白条带通过ECL化学发光底物（Beyotime，P0018S）显色，然后在Bio-Rad公司的ChemiDoc MP成像系统上拍照。条带强度是通过ImageJ（v1.53）进行量化处理的，并以GAPDH的表达量为基准进行归一化。

CSE是通过将一支商业香烟的烟气吸入注射器中，然后缓慢将其注入15毫升的无菌无血清细胞培养基（BD Falcon）中制得的。一支香烟的烟气量足够制备10毫升的CSE溶液。所得的CSE溶液需通过0.22微米的过滤器过滤，以去除不溶性颗粒物，最终得到的CSE溶液被视为100%浓度的CSE。该溶液会被分装后储存在-80摄氏度环境中，以备后续使用。在用于细胞处理时，CSE会按照所需浓度（5%）稀释到细胞培养基中（Araya等人，2019年）。

BEAS?2B人支气管上皮细胞是在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳浓度的培养箱中培养的。这些细胞会被暴露在5%的CSE环境中48小时，以此模拟烟雾引起的细胞应激。CSE处理之后，按照制造商的方案，使用Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen，15338100）将针对CXCL3的小干扰RNA（siRNAs）以及非靶向的siRNA对照剂转染到BEAS?2B细胞中。在检测MAPK信号通路抑制剂的作用时，细胞会分别先用10微摩尔的p38抑制剂（SB203580，MCE，HY?10256）、10微摩尔的ERK抑制剂（U0126，MCE，HY?12031A）或10微摩尔的JNK抑制剂（SP600125，MCE，HY?12041）处理1小时。用于CXCL3敲低的siRNA序列如下：siCXCL3–1F：5′-UCGAAAGAUACUGAACAA?3′，siCXCL3–1R：5′-UUGUUCAGUAUCUUUCGAA?3′；siCXCL3–2F：5′-GGAAUUCACUACACUCCGAA?3′，siCXCL3–2R：5′-UUGGAGUGUAGUGAAUCCAA?3′；siCXCL3–3F：5′-CGGAGUCUUCACGGAAGCAA?3′，siCXCL3–3R：5′-UUGCUUCCGUGAAGACUCCG?3′。CXCL3敲低的效率是通过qRT-PCR来验证的，以GAPDH作为内参。

细胞增殖情况是通过使用EdU细胞增殖检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，C10337）检测5-乙炔基-2'-脱氧尿苷的掺入情况来评估的。BEAS?2B细胞被培养后，要么在含CSE的条件下生长，要么在经过CXCL3敲低处理后的条件下生长。在规定处理时间后，向培养基中加入10微摩尔的EdU，持续2小时。之后用4%的多聚甲醛固定细胞，再通过点击化学反应标记正在增殖的细胞。细胞核用DAPI（蓝色）染色，而含有EdU的细胞则呈现红色，可在荧光显微镜下观察。随后计算出EdU阳性细胞的百分比。

细胞凋亡是通过使用TUNEL凋亡检测试剂盒（Roche，12156792910）的TUNEL assay来检测的。BEAS?2B细胞先被4%的多聚甲醛固定，然后用水合氯醛处理使其通透。按照制造商的方案进行反应，通过荧光标记的TUNEL染色来识别凋亡细胞。细胞核再用DAPI（蓝色）进行复染。TUNEL阳性细胞在荧光显微镜下呈现红色，可对其数量进行统计。

细胞迁移能力则是通过伤口愈合实验来评估的。BEAS?2B细胞在6孔板中培养至细胞长满孔底，然后用无菌的200微升移液枪头在板上制造一个划痕。之后，细胞会在含5% CSE的培养基中生长，有的组会同时进行CXCL3敲低处理。在划痕形成后的0小时、24小时和48小时分别对细胞进行拍照，然后使用ImageJ软件测量伤口面积。伤口闭合率是根据初始伤口面积与24小时或48小时时的面积差异来计算的。为研究CXCL3在体内的作用，采用了靶向肺部的腺相关病毒（AAV）递送系统。该AAV载体表达了针对CXCL3的短发夹RNA（shRNA），其靶向序列为：5'-TCATCAAGAAGATACTGAATTCAAGAGATTCAGTATCTTCTTGATGATTTTTT?3′。为实现高效的肺部特异性递送，选择了AAV9-RGDLRVS血清型。病毒包装和纯化工作由Vigene Biosciences（中国）按照制造商的标准流程完成。小鼠通过尾静脉注射最终病毒滴度为2×1011 v.g./mL的靶向肺部AAV制剂。体内实验设置了三组：对照组、COPD+shCtrl组以及COPD+shCXCL3组。在AAV给药后，于感染三周后采集肺组织以便进一步分析。

通过免疫荧光法检测在DMF诱导分化的HL?60细胞与BEAS?2B细胞共培养体系中NETs的形成情况。将HL?60细胞在70 mM二甲基甲酰胺中培养5天，使其分化为类中性粒细胞。BEAS?2B细胞则暴露于5% CSE中48小时，同时可加入或不加入用于敲低CXCL3的siRNA。CXCL3靶向siRNA和非靶向对照siRNA（siCtrl）是通过Lipofectamine 3000（Invitrogen，15338100）转染到细胞中的。共培养后，细胞先用4%多聚甲醛固定，再用0.1% Triton X?100处理以增加通透性，随后与针对CitH3（Abcam，ab510）和MPO（R&D Systems，AF3667）的一级抗体共同孵育。检测时使用与Alexa Fluor结合的二级抗体，细胞核则用DAPI进行复染。荧光图像是通过共聚焦显微镜（Zeiss，LSM 800）获取的。

在动物肺组织中检测NETs时，先使用0.1% Triton X?100处理肺组织切片以增加通透性，然后与针对CitH3和MPO的一级抗体孵育。之后再与带有Alexa Fluor标记的二级抗体孵育，细胞核同样用DAPI复染。荧光图像也是通过共聚焦显微镜（Zeiss，LSM 800）拍摄得到的。

实验结束时，通过右心室向肺部灌注冷PBS，然后取出肺部并在4℃下用4%多聚甲醛（Beyotime，P0099）固定。组织依次经过不同浓度的乙醇脱水，再用二甲苯透明处理，随后包埋在石蜡中，切成4μm厚的切片。切片经过脱蜡、复水处理后，在柠檬酸缓冲液（pH 6.0，Beyotime，P0083）中通过加热方式恢复抗原性。在室温下用5% BSA（Sigma，A1933）封闭1小时后，切片在4℃下与针对CXCL3的一级抗体（Bioss，bs?2547R，1:200）孵育过夜。用PBS冲洗后，切片在室温下与HRP标记的二级抗体（Beyotime，A0208）孵育1小时，再用DAB显色剂（Beyotime，P0203）显色，最后用苏木精复染，最后在德国的Leica DM6光学显微镜下观察。

通过用冷PBS冲洗小鼠的肺部来收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。为了进行形态学分析，将细胞离心涂布在玻璃载玻片上，然后用Giemsa染色液（Beyotime，C0121）染色。在德国的Leica DM6光学显微镜下，对每个样本至少五个随机选取的视野中的中性粒细胞比例进行测定。对于流式细胞术分析，将BALF中的细胞在4℃的黑暗环境中用与荧光素标记的抗体分别针对CD45（BioLegend，103128）、CD11b（BioLegend，101208）和Ly6G（BioLegend，127608）染色30分钟。洗涤并重新悬浮在PBS中后，将这些细胞放在BD LSRFortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上进行分析。数据使用FlowJo（v10.8）软件处理，中性粒细胞被定义为CD45?CD11b?Ly6G?细胞，其比例以总活细胞数的百分比表示。在流式细胞术分析中，每组都使用了5只小鼠（每组n=5）。

通过商业化的ELISA试剂盒，按照制造商的说明，检测BALF和细胞培养上清液中的多种炎症介质水平，包括CXCL5（Elabscience，E-EL-M0471）、G-CSF（Elabscience，E-EL-M0031）、LTB4（Elabscience，E-EL?0061）、IL-1β（Elabscience，E-EL-H0149/E-EL-M0037）和TNF-α（Elabscience，E-EL-M3063）。使用微板读取器（BioTek，美国）在450nm波长处读取吸光度值，再根据标准曲线计算出各物质的浓度。

数据以均值±标准差的形式呈现。在两组比较时，首先使用Shapiro–Wilk检验或Kolmogorov–Smirnov检验来判断数据的正态性。数据呈正态分布时采用非配对t检验，而非正态分布时则使用Mann–Whitney U检验。在多组比较时，则先进行单因素或双因素方差分析，然后再用Tukey的HSD检验来确定显著性差异。组织学染色、免疫组化及PAS染色图像均通过ImageJ软件进行定量分析。统计分析则使用SPSS（v28）软件完成。图表则是用GraphPad Prism（v10.1.2）软件制作的。

**片段内容**
CS诱导的COPD模型与CXCL3的鉴定：为建立小鼠COPD模型，让小鼠长期暴露于化学刺激物中。肺功能测试显示，小鼠的呼气功能出现显著受损，表现为FVC、FEV1和FEV2数值下降，FEV1/FVC%和FEV2/FVC%比值也降低。与此同时，RL和RE值上升，而Cdyn值下降，这些变化反映了气流受限以及肺力学功能的异常（见图1A和图S1A）。组织病理学分析进一步证实了类似COPD的结构改变，包括肺泡方面的变化。

**讨论**
COPD是一种复杂且异质性强的炎症性疾病。虽然吸烟已被确认为COPD的主要环境风险因素，但调控下游炎症级联反应的精确机制，尤其是那些促使中性粒细胞聚集以及形成中性粒细胞外陷阱的机制，目前仍未完全阐明（Dong等人，2025年）。因此，明确CS诱导COPD的关键分子机制对于开发针对性疗法具有重要意义。

CXCL3……

**结论**
基于本研究，我们发现CXCL3是COPD的一种新潜在治疗靶点，它通过激活MAPK信号通路来促进NETs的形成。我们的研究结果表明，靶向CXCL3能够有效抑制中性粒细胞引发的炎症，减少NETs的积累，从而在体内和体外改善肺功能受损状况。更重要的是，我们提出了一种具有前景的治疗策略，为COPD及其他相关疾病的防治提供了新的思路，值得进一步开展临床研究。

**资金支持**
本项目得到了芜湖市科学技术局项目（2024kj076）、安徽省临床医学研究转化项目（202304295107020044）、安徽省自然科学基金项目（2308085MH237）以及国家自然科学基金的支持（编号82400074、U1803126）。

**作者贡献说明**
徐千成：撰写原文初稿、可视化处理、结果验证。吴金雄：正式数据分析、数据整理。王雅妮：可视化处理、方法设计、实验实施、资金筹集。吴慧梅：软件应用、资源协调、项目管理、数据整理、概念构思。李倩：正式数据分析、数据整理。范晓云：结果验证、实验监督、资源协调、项目管理、方法设计、实验实施、资金筹集、概念构思。李业山：撰写文章的审阅与编辑工作。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

周云 | 徐千成 | 王雅妮 | 吴金雄 | 李倩 | 吴慧梅 | 李业山 | 范晓云