乳酸相关的H3K18甲基化参与了IGF2BP2介导的MARCKSL1 mRNA稳定性维持以及LPS诱导的急性肺损伤中的炎症信号传导

《Molecular Immunology》：Lactate-associated H3K18 lactylation is involved in IGF2BP2-mediated MARCKSL1 mRNA stabilization and inflammatory signaling in LPS-induced acute lung injury

　　•IGF2BP2通过m6A依赖性机制稳定MARCKSL1 mRNA，从而引发急性肺损伤。•乳酸诱导的H3K18乙酰化可上调受损肺组织中IGF2BP2的转录水平。•乳酸-H3K18la-IGF2BP2-MARCKSL1轴将代谢过程与肺部炎症联系起来。•药物抑制IGF2BP2可减轻小鼠的肺损伤，显示出潜在的治疗前景。

引言
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种急性炎症性肺病，其特征为肺血管通透性增加、肺组织密度升高以及通气肺区域减少（Meyer等人，2021年）。这种病症的较轻形式被称为急性肺损伤（ALI）（Bos和Ware，2022年）。尽管在了解临床流行病学及支持性治疗方面已取得显著进展，但ALI仍是一种具有高度异质性且死亡率极高的综合征（Zhang等人，2024年）。ALI病理生理学的核心驱动因素是肺泡上皮内失控且剧烈的炎症级联反应。因此，亟需了解能够快速放大这些炎症反应的表观遗传和转录后机制，以便找到新的靶向治疗方法。

N6-甲基腺苷（m6A）是最常见的mRNA修饰形式，它能够以可逆方式在转录后调控靶基因，进而影响几乎所有重要的生物过程（Hong等人，2022年）。这一可逆过程主要由m6A甲基转移酶复合物控制，该复合物包括m6A写入蛋白、擦除蛋白以及读取蛋白（Han和Xu，2023年）。m6A修饰在肺病的发生与发展中起着关键作用，尤其是肺癌和肺纤维化（Zhang等人，2021年；Zhang等人，2023年；Sun等人，2022年；Cao等人，2024年）。在我们的研究中，我们重点关注了m6A读取蛋白——胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2），因为它在促进特定靶mRNA的稳定及翻译效率方面发挥着重要作用。越来越多的证据表明，IGF2BP2是连接早期代谢应激与后续转录及炎症反应的关键枢纽。然而，m6A读取蛋白在ALI发病机制中的作用仍不十分清楚。

MARCKSL1（肉豆蔻酰化丙氨酸富集型C激酶底物样蛋白1）在多种细胞功能中起着重要作用（Chanda等人，2019年；Kondrychyn等人，2020年）。它负责调节对细胞运动性、形态及信号传导至关重要的肌动蛋白细胞骨架。MARCKSL1可作为蛋白激酶C（PKC）的底物，其磷酸化状态会影响细胞的黏附与迁移能力（Bjorkblom等人，2012年；Tanaka等人，2018年；Gronloh等人，2023年）。MARCKSL1还通过与磷脂和肌动蛋白丝相互作用来调节信号转导通路，从而影响细胞动态（Kondrychyn等人，2020年）。最新的研究结果表明，MARCKSL1与多种呼吸系统疾病的发生发展有关，如哮喘、肺癌、慢性阻塞性肺病以及ALI/ARDS（Sheats等人，2019年）。作为下游靶标，MARCKSL1是一种具有生物学意义的炎症效应分子，因为MARCKSL1/MRP参与了上皮细胞间接触的构建、肌动蛋白细胞骨架的重塑、细胞因子相关的紧密连接屏障反应以及细胞内的激酶相关信号传导。不过，MARCKSL1在ALI中的作用仍存在较多不确定性。

在本研究中，我们探讨了IGF2BP2是否在ALI的上皮炎症反应中起作用，并研究了导致IGF2BP2表达上升的上游代谢-表观遗传机制。我们发现，在LPS诱导的ALI模型中，IGF2BP2的表达水平以及m6A的丰度均有所上升。IGF2BP2通过m6A相关机制促进了MARCKSL1 mRNA的稳定性，而MARCKSL1又进一步推动了NF-κB的激活以及炎症因子的产生。此外，我们还发现ALI发生时乳酸积累增多，H3K18la水平上升，且IGF2BP2启动子区域的H3K18la富集与IGF2BP2表达的上调密切相关。这些结果揭示了一个可能涉及乳酸、H3K18la、IGF2BP2、MARCKSL1和NF-κB的上皮炎症损伤调控轴，为进一步研究针对IGF2BP2的ALI治疗策略提供了依据。

我们从基因表达组数据库（GEO）中获取了两个公共微阵列数据集，即GSE2411和GSE60088。GSE2411包含来自对照组、机械通气组、LPS处理组以及机械通气加LPS处理组的小鼠全肺样本。GSE60088则包含了脓毒症诱导的多器官功能障碍模型中的肺、肝和肾组织的表达谱，本研究中仅使用了肺组织样本。我们使用R语言中的limma包进行了差异表达分析。由于这两个数据集是独立分析的，因此没有进行跨数据集的批次校正。预测或已标注的与IGF2BP2相关的m6A修饰转录本则来自m6A2Target数据库。我们通过重新分析GEO数据集GSE2411和GSE60088，筛选出了在ALI中表达上升的基因。随后，我们将与IGF2BP2相关的m6A修饰转录本与ALI中表达上升的基因取交集，以此确定IGF2BP2的潜在下游靶标。

实验动物
我们从温州医科大学实验动物中心获得了8–10周龄的特定病原体无感染（SPF）雄性C57BL/6小鼠，并将其饲养在该中心。这些小鼠被置于标准控制的饲养环境中（温度为24?±?1 °C，湿度为50–60%，光照周期为12小时亮/12小时暗），可随时获取食物和水。所有的实验操作都遵循该机构的规范，并已获得温州医科大学第一附属医院动物护理与伦理委员会的正式批准。按照既定的实验方案（Zhao等人，2011年），我们建立了LPS诱导的ALI模型。我们通过随机数表将小鼠分配到不同的实验组。每组的样本数量（n表示单个小鼠的数目）是根据我们的初步研究结果以及关于LPS诱导ALI的现有文献确定的，这样才能具备足够的统计功效来检测炎症指标的差异。为避免出现偏差，负责组织学评分和免疫染色定量分析的研究人员并不知道各组的小鼠所属分组。肺损伤的严重程度是通过四个指标来衡量的：出血情况、肺泡壁增厚程度、炎症细胞浸润情况以及肺泡充血程度。简而言之，被分配到ALI组的小鼠会接受一次腹腔注射，注射剂量为15?mg/kg的脂多糖（LPS，来自美国Sigma-Aldrich公司的Escherichia coli O55:B5菌株），该脂多糖事先溶解在无菌生理盐水中；而对照组的小鼠则仅接受等量的生理盐水注射。在LPS处理24小时后，我们对处死的小鼠采集支气管肺泡灌洗液以及肺组织，以便后续分析。在体内IGF2BP2敲低实验中，我们在小鼠接受LPS处理一周前，通过气管内途径给它们注射携带针对IGF2BP2的shRNA的AAV病毒载体（AAV-shIGF2BP2），或者注射对照用的AAV病毒载体（AAV-shNC）。具体而言，这些病毒载体会被稀释在50?μL的无菌生理盐水中，然后通过23号规格的导管以每只小鼠1.5?×?1010个病毒颗粒的剂量被注入小鼠体内。为了评估体内的药物抑制效果，我们在小鼠暴露于LPS之前，让它们连续7天每天接受CWI1–2（剂量为5?mg/kg，静脉注射）或溶剂对照剂的处理。在ALI模型建立24小时后，我们提取支气管肺泡灌洗液以及肺组织样本，用于进一步的分析。

体外损伤模型的建立
在开始实验之前，我们首先进行了剂量反应试验。100?μg/mL浓度的LPS处理能够成功诱导IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，同时不会对细胞存活率造成严重影响（细胞存活率仍保持在80%以上），也不会显著引发LDH的释放；而200?μg/mL的高浓度LPS则具有很强的毒性。因此，除了另有说明外，后续实验统一采用100?μg/mL浓度的LPS处理24小时的方法。实验中使用的乳酸钠（浓度为5、10或20?mM）、2-脱氧-D-葡萄糖（浓度为5、10或20?mM）以及LBH589（浓度为10或50?nM）均按照规定的浓度使用。我们通过细胞存活率测定和LDH释放测定来评估非特异性细胞毒性。在本研究中所使用的浓度下，乳酸钠、2-DG和LBH589均未显著降低细胞存活率或增加LDH的释放量。我们使用BAY11–7082（浓度为10?μM）来抑制在过表达MARCKSL1的细胞中的NF-κB信号通路。

BEAS?2B细胞是从上海福恒生物技术有限公司购买的，这些细胞被培养在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中（该培养基由美国Gibco公司生产），培养环境为37°C、5%的二氧化碳浓度。在这些细胞被100?μg/mL浓度的LPS处理24小时后，我们会对它们进行进一步的分析。

siRNA的制备
用于靶向EP300、MARCKSL1和IGF2BP2的短干扰RNA，以及一个阴性对照siRNA，都是由上海吉贝奥生物科技有限公司生产的（该公司位于中国上海）。这些siRNA的序列详见补充表1。我们使用Thermo Fisher Scientific公司的Lipofectamine 3000转染试剂，将这些siRNA转染到BEAS?2B细胞中。携带oe-MARCKSL1基因的慢病毒颗粒以及空载体颗粒也是由上海吉贝奥生物科技有限公司包装的。我们将BEAS?2B细胞以50的感染复数进行转导，转导时使用的多聚溴化乙锭浓度为5?μg/mL，转导完成后，我们再用2?μg/mL的嘌呤霉素对细胞进行7天的筛选。

检测方法
我们采用点印迹法来检测肺组织以及BEAS?2B细胞中的整体m6A RNA甲基化水平。RNA的提取是按照制造商提供的指南，使用Beyotime公司的TRIzol试剂进行的。等量的RNA被变性后点在带正电荷的尼龙膜上，随后进行紫外线交叉链接处理。在室温下用5%脱脂牛奶处理1小时以进行封闭处理之后，我们将膜在4°C下用抗m6A抗体（编号为68055–1-Ig，来自Proteintech公司，稀释比例为1:1000）处理一整夜。洗涤步骤完成后，我们再用与HRP结合的二级抗体处理膜1小时。蛋白质信号是通过ECL试剂检测出来的，图像则是使用GE公司的Amersham Imager 600仪器拍摄的。甲基蓝染色被用作加载控制，用来检测总RNA的含量。

凋亡检测
我们使用TUNEL凋亡检测试剂盒来进行凋亡检测。之后，在黑暗条件下，我们用TUNEL试剂和DAPI对细胞核进行30分钟的染色处理。相对TUNEL比率是通过计算呈TUNEL阳性反应的细胞核所占的比例，再除以细胞核的总数来得到的，计算公式为（TUNEL/DAPI）×?100%。

流式细胞术分析
我们依据BD Biosciences公司的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书，使用流式细胞术来检测细胞的凋亡情况。具体来说，我们从每个处理组中采集BEAS?2B细胞，先用冰冷的PBS洗涤两次，然后再将其悬浮在结合缓冲液中。之后，这些细胞在室温下的黑暗环境中与Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）共同孵育15分钟。孵育结束后，我们使用BD Accuri C6流式细胞仪来分析样本，从而确定细胞凋亡的百分比。作为背景对照，我们也会用仅含Annexin V或PI染色缓冲液的溶液来处理细胞，以此检测非特异性染色情况。处于早期凋亡阶段的细胞被定义为Annexin V?+?/PI-，而处于晚期凋亡阶段的细胞则被定义为Annexin V?+?/PI?+。我们使用FlowJo软件对数据进行分析，凋亡率则是根据每组中Annexin V?+?/PI-细胞和Annexin V?+?/PI?+细胞所占的比例来计算的。为了确保实验结果的重复性，所有的实验都是重复三次进行的。

细胞因子检测
我们按照相应试剂盒的说明书，使用ELISA方法检测C57BL/6小鼠的细胞培养液、支气管肺泡灌洗液以及血清中的IL-1β（试剂盒编号为JM?02322M1，来自京美生物技术有限公司）、IL-6（试剂盒编号为YBSJL20268，来自J&L Biological Co. Ltd公司）、TNF-α（试剂盒编号为M980483，来自Macklin Technology Corporation公司）、IL-17A（试剂盒编号为YJL20251，来自J&L Biological Co. Ltd公司）、IFN-β（试剂盒编号为ab252363，来自Abcam Trading Co. Ltd公司）以及GM-CSF（试剂盒编号为M980493，来自Macklin Technology Corporation公司）的浓度。在检测这些细胞因子浓度时，我们会根据相应样本中的总蛋白质含量对数值进行校正。

免疫组化检测
我们将4微米厚的肺组织切片在4°C下与一级抗体过夜孵育。经过三次PBS洗涤后，我们再加入二级抗体进行染色。最终的结果是在德国的Leica显微镜下观察的。在免疫组化检测中，我们使用了IGF2BP2抗体（编号为11601–1-AP，来自Proteintech公司，稀释比例为1:100）和MARCKSL1抗体（编号为EPR28261–90，来自Abcam公司，稀释比例为1:500）。

免疫荧光检测
我们利用免疫荧光技术来观察肺部中性粒细胞的募集情况以及NETosis现象。具体操作是：首先将4微米厚的石蜡包埋肺组织切片进行脱蜡、水合处理，随后进行表位暴露处理。在完成通透化处理（使用0.3%的Triton X?100溶液）和非特异性阻断处理（使用5%的BSA溶液）之后，我们让这些样本在4°C下与针对Ly6G（试剂盒编号为IRS167RB，来自HUABIO公司，稀释比例为1:100）、Cit-H3（试剂盒编号为97272，来自Cell Signaling Technology公司，稀释比例为1:1000）以及NF-κB p65（试剂盒编号为80979–1-RR，来自Proteintech公司，稀释比例为1:500）的一级抗体共同孵育过夜。我们使用Leica荧光显微镜来获取显微图像，然后通过ImageJ软件对图像中的荧光强度进行定量分析。

实验技术细节
定量实时PCR
我们使用Beyotime公司的TRIzol试剂从肺组织及细胞中提取总RNA。提取出的RNA随后在8条反应管中，按照CWBIO公司提供的说明，使用HiFiScript cDNA合成试剂盒转化为cDNA。在进行定量实时聚合酶链反应时，我们使用了CWBIO公司生产的SYBR Green PCR Master Mix试剂，同样遵循该公司的使用指南。

染色质免疫沉淀结合定量PCR
为了研究表观遗传因子与DNA的结合情况，我们使用了Cell Signaling Technology公司的Simple ChIP Enzymatic Kit（试剂盒编号为#9003）来进行ChIP检测。具体操作是：先将大约1?×?107个BEAS?2B细胞在1%的甲醛中固定10分钟，之后用125?mM的甘氨酸将反应体系中的甲醛中和掉。细胞裂解后，我们用微球菌核酸酶处理基因组物质，从而得到长度在200–500碱基对之间的染色质片段。在后续的沉淀实验中，我们使用了10?μg的这类染色质片段。

ALI小鼠肺组织中IGF2BP2的水平升高
为探究m6A修饰在ALI中的作用，我们建立了LPS诱导的ALI模型。ALI模型经H&E染色的肺组织切片显示，与假手术组相比，存在明显的肺泡水肿（图1A）。相应地，ALI的诱导导致肺湿/干比值以及BALF中总蛋白浓度显著升高（图1B、C），同时ALI小鼠BALF中的促炎因子也大幅上升，包括IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17A、IFN-β和GM-CSF（图1D）。

讨论
表观转录组学领域的最新进展强调了m6A修饰在多种疾病中的作用，尤其是肺部疾病（Zhang等人，2021年；Zhang等人，2023年；Zhang等人，2022年；Sun等人，2022年；Cao等人，2024年；Yu等人，2023年；Wang等人，2024年）。已知m6A会影响mRNA的稳定性和翻译过程，从而在应激和损伤情况下影响基因表达（Shulman和Stern-Ginossar，2020年）。IGF2BP2在肺部疾病中的作用也日益受到关注。

作者贡献
彭阳迪、张俊尧、杨阳、林扬静和吴佩良负责该研究的构思与设计，并全程监督项目进展。彭阳迪、张俊尧、蔡飘飘负责实验操作。彭阳迪、林扬静和杨阳负责结果分析并撰写论文。

CRediT作者贡献说明
张俊尧：正式分析、数据整理、概念构建。彭阳迪：方法学、资金获取、正式分析、数据整理、概念构建。林扬静：资金获取、正式分析、数据整理、概念构建。杨阳：研究实施、资金获取、正式分析、数据整理。吴佩良：监督、资源协调、项目管理、方法学、研究实施、资金获取、正式分析、数据整理、概念构建。蔡飘飘：

伦理审批
所有实验均遵循相关指南规定的流程，并已获得温州医科大学第一附属医院动物护理与伦理委员会的批准（批准号：2021–0166）。

资金支持
本研究得到了浙江省自然科学基金的资助，项目编号为LY22H010003，同时温州医科大学第一附属医院的青年优秀项目（QNYC114）也提供了额外资金支持。

利益冲突声明
无。

彭阳迪|张俊尧|杨阳|林扬静|蔡飘飘|吴佩良