《Neuroscience》：Air-Liquid interface midbrain organoids model the pathological features of Parkinson’s disease
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人类诱导多能干细胞衍生的中脑类器官为模拟帕金森病（PD）提供了一个有前景的平台。然而，由于缺乏小胶质细胞以及在成熟过程中会出现坏死核心，其应用受到了限制。在此，研究人员提出了一种气液界面（ALI）切片培养系统，用于中脑类器官的长期培养，实现了高效的小胶质细胞整
人类诱导多能干细胞衍生的中脑类器官为模拟帕金森病（PD）提供了一个有前景的平台。然而，由于缺乏小胶质细胞以及在成熟过程中会出现坏死核心，其应用受到了限制。在此，研究人员提出了一种气液界面（ALI）切片培养系统，用于中脑类器官的长期培养，实现了高效的小胶质细胞整合、改善的神经元存活率以及增强的功能成熟度。单细胞RNA测序表明，与悬浮培养中生长的传统mORGs相比，ALI方法支持小胶质细胞祖细胞更一致的植入，并促进星形胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞的发育。在功能上，通过3D微电极阵列记录测量，ALI-mORGs表现出稳健且可复现的神经网络活动，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）刺激能够可靠地诱导同步爆发。重要的是，暴露于α-突触核蛋白（αSyn）预形成原纤维引发了磷酸化αSyn包含物的进行性积累，密切再现了PD病理的关键特征。ALI-mORG模型解决了现有系统的主要局限性，为研究PD的细胞机制和为支持未来的治疗策略提供了一个更具生理相关性的平台。
帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性运动障碍，其特征是黑质中多巴胺能神经元的选择性丧失以及神经元和神经胶质细胞中聚集的α-突触核蛋白的积累，这是突触核蛋白病的共同标志。尽管动物模型提供了重要见解，但将临床前结果转化为有效的靶向治疗手段仍然受限。大多数在动物试验中表现出良好效果的化合物在临床试验中均告失败，这凸显了迫切需要基于人类的、兼具生理相关性的疾病模型。随着干细胞技术的进步，生成具有人类脑组织特征的人诱导多能干细胞衍生模型成为可能。与此同时，体外模型逐渐从简单的单层细胞培养转向三维类器官和微流控平台，以更好地再现人类神经回路复杂的结构和功能。
研究人员发现，目前的大多数PD体外类器官模型通常使用携带已知致病突变的hiPSCs细胞系进行构建，或者通过施加毒性试剂来诱导神经元变性。虽然这些方法再现了PD的部分病理特征，但共同的主要局限性是缺乏小胶质细胞，即中枢神经系统（CNS）的常驻免疫细胞。在正常的体内胚胎发育过程中，中胚层来源的红髓系祖细胞迁移进入CNS并分化为小胶质细胞，但在导向分化方案中hiPSCs被诱导趋向外胚层谱系，从而抑制了中胚层分化并阻止了内源性小胶质细胞的生成。由于小胶质细胞在突触修剪、神经炎症和PD的αSyn病理发展中起着关键作用，其缺失极大限制了模型的研究价值。此外，传统的器官型悬浮培养常因氧气和营养物质扩散不足而出现中央坏死核心，损害长期培养过程中的神经元存活率和小胶质细胞的稳态。为解决上述问题，研究人员在先前针对皮层类器官的研究基础上，将ALI切片培养方法应用于在功能化丝素蛋白支架上生长的mORGs。研究探讨了ALI培养是否能增强神经元功能并支持小胶质细胞的有效植入，并通过将健康供体来源的ALI-mORGs暴露于αSyn预形成原纤维来模拟散发型PD。该研究表明ALI培养促进了神经元成熟和小胶质细胞整合，同时能够发展出αSyn病理的关键特征，支持将ALI-mORGs作为研究PD机制的平台，该研究成果发表在《Neuroscience》期刊上。
为了开展此项研究，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：使用商业化及健康供体来源的hiPSCs，结合功能化丝素蛋白支架进行中脑类器官的诱导分化与长期培养。在体外培养第30天将完整的类器官切片并转移至气液界面培养系统，同时引入同基因型的小胶质细胞祖细胞进行共培养。在研究方法上，结合了RT-qPCR和免疫荧光染色进行基因与蛋白表达的表征验证；利用单细胞RNA测序对类器官进行细胞图谱构建和转录组学分析；并运用三维微电极阵列记录和全细胞膜片钳技术对神经元的电生理活性及网络功能进行精准评估。
研究结果部分详细介绍如下：
ALI-mORGs的生成与表征
研究人员将mORGs在功能化丝素蛋白支架中进行培养以增强营养扩散并防止切片前发生坏死，并在类器官培养第30天将其切成500微米厚的切片用于ALI培养。RT-qPCR分析显示，中脑特异性标志基因（FOXA2、LMX1A、TH和NR4A2）的表达随时间显著增加，而多能性标志基因NANOG表达下降。成功切片的ALI-mORGs外观呈现均质且半透明状。免疫荧光染色证实FOXA2+/TH-的祖细胞主要分布在切片中部，而成熟的MAP2+/TH+神经元则更靠近切片边缘。研究人员将小胶质细胞祖细胞均匀分散至ALI-mORG切片上，并在两个月后评估其植入情况。结果显示，未添加祖细胞的切片未检测到内源性Iba1+细胞，而添加了祖细胞的切片则含有分布均匀且具有分支形态的Iba1+小胶质样细胞。活细胞成像进一步表明这些细胞具有动态监视行为。相比之下，悬浮共培养的完整类器官表现出极低的小胶质细胞整合效率。这证明了对切片mORGs进行ALI培养能够实现神经元的稳健成熟以及功能性小胶质细胞的长期且空间有序整合。
ALI条件显著增加mORGs中NMDA诱导的神经元活动
研究通过微电极阵列记录比较了三种不同格式的mORGs在NMDA诱导下的神经元活性。结果显示，完整类器官中记录到活跃反应的电极比例极低（1.7%），急性新鲜切片有中等程度的提升（16.4%），而维持了较长期的ALI-mORG切片几乎在所有记录电极（94.9%）中都产生了电活动。完整的mORGs仅显示出微小的诱导放电或局部场电位，而ALI-mORGs则表现出广泛、切片层面的同步网络爆发，并在α、β、δ和θ频率上呈现稳健的振荡。全细胞膜片钳记录表明，ALI-mORGs中的神经元在电流注入下表现出重复的动作电位放电，并在电压钳下记录到自发性突触后电流。结果表明，长期的ALI培养增强了mORGs中功能性神经网络成熟度。
90 DIV ALI-mORGs的单细胞转录组分析
为了全面表征包含小胶质细胞的ALI-mORG切片的细胞组成，研究人员在90 DIV时进行了单细胞RNA测序。无监督聚类分析确定了15个不同的细胞群落，其中神经元是最丰富的细胞类型，占总数的42%，分布在四个集群中；神经祖细胞占29.4%。非神经细胞占总数的28.6%，包括神经嵴样细胞、间充质样细胞、成纤维样细胞和小胶质样细胞。对小胶质细胞簇的基因本体富集分析揭示了与吞噬作用、溶酶体功能和免疫信号传导相关的通路。免疫荧光成像证实整合的小胶质细胞与突触发生了相互作用，能够吞噬突触并在邻近细胞核周围形成吞噬杯状结构。这些结果证明ALI-mORGs再现了复杂的多细胞中脑样微环境，包含多样化的神经元亚型和功能活跃的小胶质细胞。
暴露于αSyn PFFs的ALI-mORGs模拟PD的突触核蛋白病
为了评估ALI系统是否能够模拟PD相关病理，研究人员在100 DIV时将ALI-mORGs暴露于超声处理的αSyn PFFs。暴露后两到三周，磷酸化αSyn主要在神经突中被检测到。六到七周后，出现了球形的核周汇聚聚集体，表明αSyn病理从神经突向胞体进展。免疫荧光染色证实这些聚集体主要是神经元的，因为pSer129-αSyn标记的聚集体与β3-tubulin和MAP2标记的细胞共定位，并在少数弱阳性TH神经元中也被观察到。值得注意的是，部分球形聚集体被一层强染色的β3-tubelistin晕圈包围，这表明在应对αSyn积累时发生了局部的神经突重塑。通过αSyn PFFs诱导的ALI-mORG中的聚集体在形态上与在人类PD中脑样本中发现的包涵体高度相似。这些结果表明，αSyn PFF暴露在ALI-mORGs中诱导了渐进式的神经元αSyn病理，其空间和时间特征均贴近PD中观察到的路易体样包涵体。
αSyn PFFs暴露改变神经元兴奋性
研究人员在暴露后三周通过MEA记录评估了神经元活性。在未处理的类器官中，对NMDA刺激表现出双相反应：最初是高活性的爆发，随后是放电频率的降低和稳定。伴随100微摩尔多巴胺的加入会引起神经元活动的明显静息，且在撤除多巴胺后未能恢复。而在αSyn PFF处理的ALI-mORGs中，研究人员观察到了在初始NMDA反应之后的持续性兴奋，且具有统计学显著性。这些结果表明，αSyn PFF暴露破坏了ALI-mORGs中正常的NMDA-和多巴胺调节的网络动力学，导致了与早期突触核蛋白病相关功能障碍相符合的持续过度兴奋。
αSyn PFFs触发ALI-mORGs中全局和细胞类型特异性的基因表达变化
为了研究αSyn病理引发的转录组变化，研究人员将暴露于αSyn PFFs七周后的样本（150 DIV）处理后进行scRNA-seq。无监督聚类识别出15个不同的细胞集群。与早期阶段不同，胶质细胞在此时占细胞群体的68%，这反映了从神经发生到胶质发生的暂时性转变。其中包括少突胶质细胞祖细胞、星形胶质细胞、髓鞘形成少突胶质细胞和室管膜样细胞。研究人员分析了四种关键的细胞类型，发现大多数差异表达基因在星形胶质细胞和OPCs中鉴定出来。基因集富集分析显示，所有四种细胞类型中存在共同的转录反应，包括呼吸链基因的上调。在神经元中，与错误折叠蛋白反应和蛋白质运输相关的通路出现下调；少突胶质细胞表现出磷脂代谢过程相关基因的下调；星形胶质细胞则呈现出向反应性状态的转变，如GFAP、ALDOA和多种金属硫蛋白基因的表达增加。此外，OPCs中VEGFA、EDIL3和HAS2的表达显著上调，提示OPCs可能在PD的血管重塑和血脑屏障完整性中发挥作用。
讨论部分
研究人员的讨论表明，ALI切片培养增强了脑类器官中小胶质细胞祖细胞的植入效率，且在没有任何外源细胞因子添加的情况下，内源性类器官衍生因子足以驱动小胶质细胞的存活与成熟，单个类器官所需的小胶质祖细胞数量相较于传统培养大幅降低。其次，ALI-mORGs展现出了卓越的神经元网络活动和结构完整性，有效克服了完整类器官因坏死核心导致的电生理记录困难，显著提升了实验的可复现性。在模拟路易体样αSyn病理方面，研究证实单次短暂的αSyn PFFs暴露即可在健康的神经元中引发类似路易体的渐进性包涵体形成。单细胞转录组分析进一步精确揭示了αSyn聚集引发的多细胞类型广泛的分子紊乱。在所有关键细胞类型中均观察到呼吸链复合物组装相关基因转录显著增加，支持αSyn作为一种潜在的线粒体毒素诱导能量代谢衰竭的病理假设。同时，广泛参与铁离子转运和储存相关基因的下调表明αSyn聚集可能早于并驱动了脑内铁失衡。虽然研究存在由于不同细胞系间分化效能差异以及单细胞测序过程中因物理解离和分选导致的细胞损失等客观技术局限性，部分成熟神经元和小胶质细胞在scRNA-seq中可能被低估，但免疫染色在组织水平上证实了细胞维持在切片中稳定的分布密度。
研究结论
ALI-mORG培养系统提供了一个具有高度生理相关性的研究平台，可用于深入探究PD潜在的细胞与分子运作机制。该系统允许高效的小胶质细胞整合、长期结构活性维持以及通过3D-MEA记录证实的显著增强的神经网络电生理活动。由此构建的神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及其祖细胞的3D共培养微环境，比传统的2D细胞模型更为真实地再现了人脑组织生态。OPCs和髓鞘化少突胶质细胞的出现为探索炎信号传导、神经元易感性及血脑屏障潜在功能障碍提供了新的见解。更关键的是，αSyn PFFs暴露成功诱导了类路易体包涵体形成，再现了PD的核心神经病理学特征。该系统可灵活应用于患者来源的细胞，实现个性化基因型和表型驱动下神经退行性变机制的全面考察。单细胞RNA测序数据进一步揭示了胶质细胞对αSyn聚集产生的强烈转录改变，突出了非细胞自主机制在神经变性和PD病理中的重要地位。总体而言，ALI-mORG模型极大地促进了针对胶质与神经元在PD病程中相互作用的广泛研究，为发现新型治疗靶点及评估潜在的疾病修饰疗法奠定了坚实基础。
