《Neuroscience》：The priming factor, CAPS, mediates somatic exocytosis of serotonin
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研究人员在水蛭（leech）的大型Retzius神经元中研究了囊泡启动因子CAPS（钙离子依赖性分泌激活蛋白，calcium-dependent activator protein for secretion）在血清素（serotonin）胞体胞吐作用（som
研究人员在水蛭（leech）的大型Retzius神经元中研究了囊泡启动因子CAPS（钙离子依赖性分泌激活蛋白，calcium-dependent activator protein for secretion）在血清素（serotonin）胞体胞吐作用（somatic exocytosis）中的角色。增强的电活动促使Retzius神经元仅从胞体致密核心囊泡（dense-core vesicles, DCVs）簇集体释放血清素。这种胞吐作用与突触处的胞吐作用大不相同，而与内分泌细胞中的胞吐作用相似。因此，驱动DCV融合的分子复合物可能由特定类型的蛋白质组成。研究人员从Retzius神经元特异性转录组（transcriptome）开始寻找此类蛋白质。通过在水蛭中枢神经节（central ganglia）中的原位杂交（in situ hybridization, ISH）证实了转录组中水蛭CAPS（Hve-CAPS1）mRNA的高水平表达。在Retzius及其他神经元类型的胞体中观察到致密染色。免疫染色（Immunostaining）显示该蛋白在胞体壳层（soma shell）和核周（nuclear periphery）积累，而DCV也在这些区域积累。通过向培养的神经元注射合成干扰RNA（synthetic interfering RNA, siRNA）混合物以敲低Hve-CAPS1，从而检验其在胞吐中的作用。胞吐作用通过40?mM钾去极化（potassium depolarization）刺激，并测量为荧光斑点（fluorescent spots），每个斑点由DCV簇在胞吐/胞吞循环（exo/endocytosis cycles）中被FM1-43染色产生。与注射乱序序列（scrambled sequence）的对照组相比，敲低Hve-CAPS1导致胞体FM1-43斑点减少51.6%，表明参与融合的囊泡簇有同等程度的减少。Hve-CAPS1对DCV启动的贡献，为神经元胞体胞吐作用的保守机制引入了一个高度调控的启动步骤。
**论文解读：CAPS在水蛭Retzius神经元胞体胞吐中的启动作用**
**研究背景与问题**
神经元除在突触释放神经递质外，还能从胞体、树突、轴突等部位通过胞吐作用释放神经递质和/或肽类，这种释放被称为突触外释放（extrasynaptic release）。突触外释放主要涉及致密核心囊泡（dense-core vesicles, DCVs），其释放的分子（如单胺类、肽类）可整合神经元、胶质细胞和血管的功能，进而调节整个回路和行为。然而，驱动DCV融合的分子复合物与突触中快速释放的机制不同：突触融合依赖低亲和力钙传感器（如synaptotagmin 1/2/9）及VAMP、SNAP-25等蛋白，而DCV的启动与融合则涉及高亲和力钙传感器及特定调控因子，如syntaxin-1、munc-18和CAPS（钙离子依赖性分泌激活蛋白，calcium-dependent activator protein for secretion）。CAPS在多种物种中高度保守，参与DCV的启动，但其在神经元胞体胞吐（somatic exocytosis）中的具体作用尚不明确。水蛭（Hirudo verbana）的血清素能Retzius神经元因其胞体含有大量DCV簇，且释放机制与内分泌细胞类似，成为研究突触外胞吐的理想模型。前期研究已发现Retzius神经元特异性转录组中存在CAPS，但未验证其功能。因此，本研究的目的是探究CAPS在血清素胞体胞吐中的作用，并揭示其分子机制。
**研究内容与结论**
研究人员利用水蛭Retzius神经元，结合转录组学、系统发育分析、原位杂交（ISH）、免疫荧光染色及RNA干扰（RNAi）等技术，系统分析了CAPS的表达及其对胞体胞吐的影响。结果显示：水蛭具有三个CAPS基因（Hve-CAPS1、2、3），其中Hve-CAPS1在Retzius神经元中高表达，且其蛋白分布于胞体壳层和核周，与DCV共定位。通过显微注射合成干扰RNA（siRNA）敲低Hve-CAPS1表达后，经40?mM钾去极化刺激的胞体胞吐荧光斑点数量显著减少51.6%，表明Hve-CAPS1是DCV启动的关键因子。该研究首次证明CAPS参与神经元胞体胞吐的启动步骤，为理解突触外释放的保守机制提供了新见解。论文发表在《Neuroscience》。
**主要关键技术方法**
研究人员从水蛭（Hirudo verbana）中枢神经节中分离Retzius神经元，利用该神经元特异性转录组（Heath-Heckman et al., 2021）筛选CAPS基因，并通过系统发育分析（Maximum-Likelihood树）确定其进化关系。采用原位杂交（ISH）和免疫荧光染色检测Hve-CAPS1 mRNA和蛋白表达；通过显微注射含三种Hve-CAPS1特异性siRNA序列的混合物（约0.3?μg/μl）至培养的神经元，以敲低目标蛋白。胞体胞吐通过40?mM钾去极化刺激，并加入FM1-43荧光染料（10?μM）染色，利用荧光显微镜（60×油镜）检测Z轴堆栈图像，统计胞体赤道平面上的荧光斑点数量，以反映DCV簇的融合事件。
**研究结果**
- **水蛭CAPS同源物的序列比较**：通过成对BLASTP比对，确认水蛭存在三个CAPS基因（Hve-CAPS1、2、3），其中Hve-CAPS1与Hve-CAPS3相似度最高（53.61%同一性），与Hve-CAPS2相似度较低（36.77%同一性），支持它们为不同旁系同源物。
- **Hve-CAPS1与无脊椎动物及脊椎动物直系同源物的同源性**：BLASTP分析显示，Hve-CAPS1与人类CAPS-1（53.89%同一性）、大鼠CAPS-1（55.76%）、小鼠CAPS-1（53.48%）、斑马鱼CAPS-1（49.61%）以及线虫UNC-31（46.43%）和果蝇Cadps（58.09%）均有显著匹配，表明其高度保守。
- **水蛭与脊椎动物CAPS旁系同源物的独立复制**：最大似然系统发育树显示，水蛭的三个CAPS基因与脊椎动物的两个CAPS基因分别起源于独立的复制事件，而非直系同源关系。
- **Hve-CAPS变体在Retzius及其他神经元中的RNA表达**：转录组分析表明，Hve-CAPS1在Retzius神经元中表达最高，Hve-CAPS2低10倍，Hve-CAPS3几乎检测不到；而机械感觉神经元（T、P、N）则表达所有三种变体，但Hve-CAPS1水平比Retzius神经元低约70%。
- **Hve-CAPS1在神经节中的表达**：ISH检测显示Hve-CAPS1 mRNA在Retzius神经元、三种机械感觉神经元及多种运动神经元（如AE、CV、HE、152）和中间神经元中高表达。免疫荧光染色显示蛋白在Retzius神经元胞体壳层和核周积累，与DCV标志物synaptophysin的分布一致，且小胶质细胞也呈阳性染色。
- **siRNA敲低CAPS**：显微注射siRNA混合物至左侧Retzius神经元后，ISH显示Hve-CAPS1 mRNA信号显著减弱，免疫荧光强度也显著下降，而注射乱序序列的右侧神经元染色正常，证实敲低成功。
- **Hve-CAPS1敲低减少胞体胞吐**：在培养的神经元中，敲低组经钾去极化后，FM1-43荧光斑点中位数（11个）显著低于对照组（14个），减少51.6%。强度分布分析显示，敲低主要消除50%–60%的低至中等强度斑点，以及80%以上的高强度斑点，表明大DCV簇的融合受抑制更明显。
**总结与讨论**
本研究证明了高度保守的Hve-CAPS1在水蛭Retzius神经元DCV胞体胞吐中发挥关键作用。Hve-CAPS与synaptophysin的荧光分布模式与先前电镜观察到的DCV分布一致，提示CAPS与DCV共定位。敲低Hve-CAPS1导致FM1-43斑点减少，且大簇的融合抑制更显著，可能由于新形成的较大DCV簇（含500–1200个囊泡）在缺乏启动因子时无法融合，而旧簇的残留胞吐仍可发生。此外，CAPS缺失可能通过破坏血清素释放的正反馈循环（血清素激活自受体→IP3→胞内钙释放→促融合）进一步加剧融合缺陷。值得注意的是，水蛭拥有三个CAPS旁系同源物，而其他无脊椎动物仅有一个，脊椎动物有两个，这可能是独立基因复制的结果。Hve-CAPS1在Retzius神经元中高表达，而Hve-CAPS2和3可能分别参与突触或不同区域的胞吐。小胶质细胞中Hve-CAPS1的表达提示其可能具备SNARE介导的胞吐能力，参与神经元-胶质反馈通信。
**研究结论**：Hve-CAPS1对DCV启动的贡献，为神经元胞体胞吐作用的保守机制引入了一个高度调控的启动步骤。
