和厚朴酚通过PPARγ介导的ERK/AKT信号通路减轻多发性硬化小鼠模型的神经炎症并增强再髓鞘化

《Neurotherapeutics》：Honokiol attenuates neuroinflammation and enhances remyelination in mouse models of multiple sclerosis through PPARγ-mediated ERK/AKT signalling

　　

多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的特征是炎性脱髓鞘和髓鞘修复不足，二者共同驱动进行性神经功能损伤。尽管现有的免疫调节治疗在减少急性复发频率方面已显示出疗效，但它们未能解决少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cell, OPC）分化和随后再髓鞘化中的关键缺陷，导致患者出现不可逆的神经功能障碍。这凸显了同时减轻神经炎症和刺激内源性髓鞘再生的药理学干预措施的迫切需求。在本研究中，研究人员利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）和cuprizone诱导的脱髓鞘模型，评估了和厚朴酚（一种源自厚朴的天然生物活性多酚）的治疗潜力。研究结果表明，和厚朴酚通过抑制胶质细胞活化、调节炎性细胞因子谱和恢复脂质稳态，改善了髓鞘恢复并发挥了强大的抗炎作用。转录组学分析表明，免疫相关通路全局下调，而参与髓鞘形成和少突胶质细胞成熟的关键信号级联显著上调。分子动力学模拟显示，和厚朴酚通过能量有利的相互作用与内源性大麻素受体和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ）稳定结合。在原代OPC培养中，和厚朴酚直接促进OPC分化为成熟少突胶质细胞。药理学阻断PPARγ取消了和厚朴酚诱导的OPC成熟以及随后的细胞外信号调节激酶/蛋白激酶B（extracellular signal-regulated kinase/protein kinase B, ERK/AKT）信号轴的激活。综上所述，这些发现表明，和厚朴酚通过免疫调节作用和对少突胶质细胞谱系细胞的直接作用，减轻神经炎症并可能促进髓鞘修复，支持其作为脱髓鞘疾病疾病修饰策略的潜力。

**论文解读：和厚朴酚通过PPARγ介导的ERK/AKT信号减轻多发性硬化小鼠模型中的神经炎症并促进再髓鞘化**

**研究背景与问题**
多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种慢性免疫介导的神经系统疾病，核心病理特征为神经炎症和脱髓鞘。全球超过280万患者，女性发病率约为男性的两倍。现有免疫疗法（如芬戈莫德）可减少复发频率，但无法有效促进髓鞘再生，导致轴突持续损伤和不可逆的神经功能障碍。再髓鞘化是内源性修复过程，依赖少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cell, OPC）分化为成熟少突胶质细胞形成新髓鞘。然而，随着年龄和病程延长，再髓鞘化效率下降，且尚无FDA批准的药物直接促进髓鞘再生。因此，亟需能够同时抑制神经炎症和刺激内源性髓鞘再生的治疗策略。和厚朴酚（honokiol）是一种源自厚朴的天然生物活性小分子，具有抗肿瘤、抗感染和抗氧化活性，因其低分子量和强亲脂性可高效穿透血脑屏障，在多种中枢神经系统疾病模型中显示神经保护作用。本研究旨在评估和厚朴酚在MS模型中的抗炎和促髓鞘再生潜力，并阐明其分子机制。

**主要技术方法**
研究采用8周龄雌性C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）和cuprizone诱导的脱髓鞘模型（均购自上海斯莱克实验动物中心）。原代OPC取自Sprague–Dawley大鼠胚胎（孕14天）。主要技术包括：组织病理学（H&E染色、Luxol fast blue染色）、透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）评估髓鞘超微结构、免疫荧光/免疫组化、Western blot、RNA测序及生物信息学分析（GO、KEGG、GSEA）、分子对接与分子动力学模拟、定量实时PCR。

**研究结果**

**1. Honokiol promotes MBP expression in cultured OPC**
通过体外原代OPC培养，免疫荧光和Western blot显示，和厚朴酚（5 μM）处理72小时后，MBP（髓鞘碱性蛋白）阳性细胞比例和蛋白表达呈浓度依赖性增加，而PDGFRα（未分化OPC标志物）无明显变化，表明和厚朴酚直接促进OPC成熟。

**2. Honokiol attenuates EAE severity and promotes remyelination**
在EAE模型中，从发病第1天起每日腹腔注射和厚朴酚（5或10 mg/kg）至第30天。与溶剂组相比，和厚朴酚显著降低临床评分、抑制体重下降，减少脊髓白质炎性细胞浸润（H&E染色）和脱髓鞘面积（LFB染色），并增加髓鞘轴突数量和髓鞘厚度（TEM），且10 mg/kg剂量效果优于芬戈莫德在增加髓鞘轴突数量方面的作用。

**3. Transcriptomic analysis reveals anti-inflammatory and pro-remyelinating signalling of honokiol in EAE mice**
脊髓RNA测序分析显示，和厚朴酚处理组有2412个差异表达基因（2095个下调，317个上调）。GSEA和KEGG富集分析表明，上调通路包括内源性大麻素、cAMP、ErbB和钙信号等与OPC成熟相关通路；下调通路包括T细胞受体、趋化因子、NF-κB、IL-17、TNF等免疫炎症通路。GO和WikiPathways分析进一步证实免疫反应和细胞因子相关通路被抑制。

**4. Honokiol modulates neuroinflammation, lipid dysregulation, and myelin maintenance in EAE mice**
免疫荧光显示，和厚朴酚减少脊髓中Iba-1⁺小胶质细胞和GFAP⁺星形胶质细胞数量。RT-PCR发现，和厚朴酚逆转EAE诱导的促炎因子（Tnf-α、Il-6、Ifn-γ、Il-1β）升高，同时降低抗炎因子（Il-10、Tgf-β、Arg1）异常升高，恢复脂质代谢基因（Cd36、ApoE、Abca1）和促凋亡因子Bax的表达，并恢复髓鞘基因Plp的表达。

**5. Honokiol promotes remyelination in the cuprizone-induced model of demyelination**
在cuprizone诱导的脱髓鞘模型中，和厚朴酚（10 mg/kg/d，腹腔注射）在撤除cuprizone后1-3周内，显著增加胼胝体中Sox10⁺/Bcas1⁺活跃髓鞘化少突胶质细胞、CC1⁺成熟少突胶质细胞数量和MBP荧光强度，效果优于已知促髓鞘化药物clemastine，且不减少Olig2⁺细胞池。

**6. Molecular dynamics simulation reveals differential binding stability of honokiol with CB1, CB2, and PPARγ receptors**
100 ns分子动力学模拟显示，和厚朴酚与CB1、CB2和PPARγ受体的结合稳定性不同：CB1复合物RMSD较高（0.53±0.03 nm），CB2最低（0.34±0.02 nm），PPARγ居中（0.40±0.03 nm）。自由能景观分析表明CB2和PPARγ结合模式更刚性强。相互作用能分析显示和厚朴酚与CB1和CB2的Lennard-Jones相互作用更强，而与PPARγ也形成稳定氢键（如Tyr327）。

**7. Honokiol promotes OPC differentiation primarily through PPARγ activation**
在体外OPC分化实验中，联合使用PPARγ拮抗剂T0070907（1 μM）完全消除和厚朴酚诱导的MBP⁺细胞增加和MBP/MAG蛋白表达升高，而CB1拮抗剂AM251或CB2拮抗剂AM630无此作用。表明和厚朴酚主要通过PPARγ促进OPC分化。

**8. Honokiol induces PPARγ-dependent ERK and Akt activation in primary OPCs**
Western blot显示，和厚朴酚（5 μM）处理OPC后，ERK1/2磷酸化在25分钟达到峰值，Akt磷酸化在5分钟迅速升高后回落，mTOR磷酸化无显著变化。PPARγ拮抗剂T0070907可阻断和厚朴酚诱导的ERK和Akt磷酸化，而CB1/CB2拮抗剂无效。表明和厚朴酚通过PPARγ激活ERK/AKT信号。

**讨论与结论**
本研究证实和厚朴酚是一种兼具免疫调节和促髓鞘再生的双功能治疗剂。在EAE模型中，和厚朴酚虽在抑制炎症浸润方面不如芬戈莫德，但独特地增加了髓鞘轴突数量，提示其具有超越免疫调节的促再生作用。在cuprizone模型中，和厚朴酚促进再髓鞘化的效果优于clemastine，且不消耗OPC储备，可能避免clemastine在临床试验中发现的加速残疾进展等副作用。机制上，和厚朴酚通过PPARγ受体激活下游ERK/AKT信号，而非CB1/CB2受体，这与既往研究（认为通过CB1/AKT/mTOR/SOX10）不同，可能因培养条件中是否包含T3等外源分化因子所致。此外，和厚朴酚还恢复脂质代谢稳态（下调Cd36、ApoE、Abca1），抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化，并调节细胞因子平衡。研究局限性在于仅使用雌性小鼠，且和厚朴酚可能作用于其他靶点（如GABA或谷氨酸受体），需进一步通过遗传工具验证。总体而言，研究结论指出：和厚朴酚通过多靶点作用，在MS模型中同时减轻神经炎症和促进髓鞘再生，其通过PPARγ介导的ERK/AKT信号通路促进OPC分化，为脱髓鞘疾病提供了有前景的疾病修饰治疗策略。该论文发表在《Neurotherapeutics》。