α6GABAA受体选择性正变构调节剂作为纤维肌痛新型疗法：慢性广泛性肌肉骨骼疼痛小鼠模型的概念验证研究

《Neurotherapeutics》：α6GABAA receptor-selective positive allosteric modulator as a novel therapy for fibromyalgia: A proof-of-concept study in mice modeling chronic widespread musculoskeletal pain

　　

纤维肌痛是一种主要由中枢敏化导致的慢性疼痛疾病，仍是未被满足的医疗需求，现有治疗疗效有限且常伴随剂量限制性不良反应。研究人员此前开发了吡唑并喹啉酮（PQ）化合物，作为首批选择性结合含α6亚基的GABAA受体（α6GABAAR）的正变构调节剂（PAM）之一。本研究中，研究人员发现PQ化合物6及其氘代可成药候选物DK-I-56-1，在双重酸性盐水注射和间歇性冷应激诱导的ICR小鼠纤维肌痛模型中，减轻了机械性异常痛和热痛觉过敏。PQ的镇痛效应存在性别二态性，雌性敏感性更高，且重复给药后未产生耐受。此外，鞘内而非全身注射α6GABAAR拮抗剂呋塞米可阻断其镇痛效应，且在Gabra6（编码α6亚基的基因）敲除小鼠中效应被消除，提示脊髓α6GABAAR参与作用。免疫荧光染色支持脊髓背角存在α6GABAAR并与NeuN共定位。腹腔注射后，DK-I-56-1的镇痛效价（雄性10 mg/kg，雌性3 mg/kg）与加巴喷丁（10 mg/kg）相当，低剂量联合给药时与加巴喷丁呈相加效应。结果表明，α6GABAAR选择性正变构调节剂如DK-I-56-1，作为单药或加巴喷丁类药物辅助治疗，是纤维肌痛疼痛管理的潜在策略。

研究背景方面，纤维肌痛是一种慢性伤害性塑性疼痛疾病，以广泛性肌肉骨骼疼痛、疲劳、情绪障碍和认知缺陷为特征，影响4%–8%人群且女性居多，是第三大常见肌肉骨骼疼痛原因。目前尚无治愈方法，加巴喷丁类药物和抗抑郁药可用于缓解症状，但受限于低响应率、疗效有限和难以耐受的副作用，因此亟需开发新的药物治疗方案。纤维肌痛被认为是一种中枢神经系统疾病，中枢敏化是核心假说，其归因于疼痛调节通路中兴奋-抑制平衡受损，GABA能抑制回路功能异常可导致中枢敏化，纤维肌痛患者脑脊液中GABA水平降低且全脑GABA_AR配体结合电位升高，提示GABA_A受体（GABA_AR）上调。含α6亚基的GABA_AR（α6GABA_AR）主要在小脑颗粒细胞高密度表达，也在脊髓背角和背根神经节（DRG）等疼痛处理关键区域少量表达，作为高亲和力GABA_AR介导由环境GABA驱动的张力性抑制，在GABA能张力降低的疾病状态中可调控伤害性信号。此前研究人员鉴定了若干吡唑并喹啉酮（PQ）作为α6GABA_AR选择性正变构调节剂（PAM），在偏头痛、三叉神经病理性疼痛和脊神经损伤诱导的神经性疼痛模型中显示强效镇痛作用，本研究进一步探讨其在纤维肌痛中的镇痛潜力。研究采用双重酸性盐水注射（ASI）和间歇性冷应激（ICS）两种小鼠纤维肌痛模型，评估PQ化合物6和DK-I-56-1对机械性异常痛和热痛觉过敏的作用，通过Gabra6全局敲除（Gabra6-KO）小鼠和鞘内/全身注射呋塞米进行基因与药理拮抗验证作用靶点，免疫荧光检测α6亚基在脊髓背角和DRG的表达与定位，并将PQ与临床用药加巴喷丁进行疗效对标及联合用药评价。研究人员得出结论，α6GABA_AR选择性PAM在两种纤维肌痛模型中均减轻伤害性反应，作用依赖于脊髓α6GABA_AR，雌性更敏感且无耐受，DK-I-56-1疗效与加巴喷丁相当并可产生相加效应，是潜在的纤维肌痛单药或辅助治疗策略，具有重要意义。本文发表于《Neurotherapeutics》。

关键技术方法包括使用6–9周龄ICR小鼠（购自Lesco Biotechnology Co., Ltd）及CRISPR/Cas9基因组编辑构建的Gabra6-KO ICR小鼠；采用双重酸性盐水注射（ASI）和间歇性冷应激（ICS）建立纤维肌痛模型；通过简化上下法（SUDO）测机械缩足阈值（PWT）和Hargreaves法测热缩足潜伏期（PWL）评估伤害性反应；利用高架十字迷宫和明暗箱测试焦虑样行为；进行脊髓、DRG和小脑组织的α6亚基三重免疫荧光共染色（与NeuN、IB4、c-Fos、N-52等标记物）及共聚焦成像分析；通过腹腔注射PQ化合物6、DK-I-56-1、加巴喷汀及鞘内/腹腔注射呋塞米（α6GABA_AR拮抗剂）进行药效与拮抗实验；采用重复测量双因素ANOVA及单因素ANOVA等进行数据统计。

研究结果如下。

Effects of PQs in the ASI model

Compound 6（i.p.） attenuated ASI-induced mechanical allodynia without tolerance, with greater sensitivity in females：在ASI模型中，腹腔注射Compound 6可恢复ASI诱导的双侧重度机械性异常痛，雄性有效剂量为10 mg/kg，雌性为3 mg/kg和10 mg/kg，雌性更敏感，重复给药至第14天未产生耐受，最大可能效应（MPE%）未随时间衰减；ASI诱导雄性和雌性出现焦虑样行为，Compound 6有减轻趋势但未达显著。

The anti-allodynic effect of Compound 6 is mediated by α6GABA_ARs

The effect of Compound 6 was abolished in Gabra6-KO mice：在Gabra6^+/+ ASI小鼠中，Compound 6（10 mg/kg, i.p.）显著提高双侧PWT，而在Gabra6^?/?小鼠中完全失效，Gabra6^+/?小鼠仅见轻微不显著效应，表明镇痛效应由α6GABA_AR介导且具基因剂量依赖性趋势，基因型间基线PWT无差异。

Spinal α6GABA_ARs are key for the anti-allodynic effect of Compound 6

The effect of Compound 6 was antagonized by i.t. but not i.p. injection of furosemide, an α6GABA_AR antagonist：全身注射呋塞米（20 mg/kg, i.p.）不影响Compound 6的镇痛效应，而鞘内注射呋塞米（10 nmol, i.t.）在雄性和雌性ASI小鼠中均阻断Compound 6的双侧抗异常痛效应，且鞘内呋塞米本身在对照小鼠中降低基础PWT，提示脊髓α6GABA_AR是主要作用位点，脊髓内源性α6GABA_AR介导张力性抗伤害作用。

The α6 subunit immunofluorescent staining in the spinal dorsal horn and DRG

The α6 subunit expression in the spinal dorsal horn：免疫荧光显示脊髓背角α6亚基与神经元核抗原（NeuN）共定位，Gabra6^+/+小鼠荧光强度显著高于Gabra6^?/?小鼠，部分与IB4（非肽能初级感觉神经元标记物）共定位；DRG中仅在大直径N-52阳性髓鞘感觉神经元见微弱信号，整体未见显著强信号，验证抗体特异性在Gabra6^?/?小脑颗粒层消失；ASI车辆组脊髓背角c-Fos升高，Compound 6可降低c-Fos表达，提示减少神经元过度激活。

Benchmarking PQs against gabapentinoids in ASI mice

The efficacy and duration of DK-I-56-1 was comparable to gabapentin：DK-I-56-1在ASI小鼠中恢复双侧PWT，雄性10 mg/kg、雌性3 mg/kg和10 mg/kg有效，雌性更敏感且无耐受；第4天比较最小有效剂量，Compound 6（10 mg/kg雄性，3 mg/kg雌性）、DK-I-56-1和加巴喷丁（10 mg/kg）均显著抗异常痛，20分钟时效应无显著差异，但Compound 6效应在120分钟内消退，DK-I-56-1和加巴喷丁持续至240分钟，0–240分钟AUC显示DK-I-56-1与加巴喷丁疗效相当。

DK-I-56-1 and gabapentin produced an additive anti-allodynic effect at low doses：低剂量DK-I-56-1（1 mg/kg）与加巴喷丁（1 mg/kg）单独使用效应轻微不显著，联合给药在雄性双侧、雌性对侧20分钟及雄性双侧、雌性同侧0–240分钟AUC显示显著相加抗异常痛效应，优于单药。

Therapeutic effects of PQs in ICS-treated ICR mice

Compound 6 attenuated mechanical allodynia in a mouse model of ICS：在ICS模型中，雄性Compound 6 10 mg/kg、雌性3 mg/kg和10 mg/kg显著减轻ICS诱导的机械性异常痛（第10–20天），无耐受，雌性3 mg/kg效应高于雄性；同时Compound 6（雄性10 mg/kg，雌性3 mg/kg） abolished ICS诱导的热痛觉过敏；ICS诱导的焦虑样行为在本品系中不显著，仅雌性开放臂距离减少。

Intrathecal furosemide pretreatment significantly attenuated the anti-allodynic effect of Compound 6 in ICS mice：ICS模型中，腹腔呋塞米不影响Compound 6镇痛，鞘内呋塞米（10 nmol）显著减弱雄性和雌性Compound 6的抗异常痛效应（持续约120分钟），非ICS雌鼠鞘内呋塞米轻微不显著降低PWT，与ASI模型一致，证实脊髓α6GABA_AR介导ICS模型中的PQ镇痛作用。

讨论部分总结：研究人员发现α6GABA_AR选择性PAM（PQ化合物）在ASI和ICS两种纤维肌痛小鼠模型中减轻机械性异常痛和热痛觉过敏，两性均有效且雌性更敏感，重复给药无耐受，效应在Gabra6-KO小鼠消除且被鞘内而非全身呋塞米阻断，核心作用位点为脊髓α6GABA_AR。传统苯二氮?类非选择性GABA_AR PAM在非镇静剂量无法镇痛，而α6选择性PQ在无显著镇静、运动损伤或成瘾性剂量下生效，两种机制不同的模型一致性支持其中枢调制作用。免疫荧光确认α6GABA_AR表达于小鼠脊髓背角浅层、中间层和深层神经元胞体，与NeuN共定位，部分与IB4共定位，鞘内呋塞米阻断效应强烈支持脊髓为主要作用部位；呋塞米不透过血脑屏障且DRG无显著α6免疫反应性，排除外周DRG主要作用，种属差异可能解释大鼠DRG报道不同。性别二态性表现为雌性更敏感，可能与激素调节α6GABA_AR表达功能或药代动力学差异有关，本研究两性均响应且峰值在30–40分钟。ASI中Compound 6未显著减轻焦虑，提示疼痛与情感障碍可能涉及不同机制，α6GABA_AR主要位于小脑颗粒细胞，但构成性敲除研究提示焦虑可能非颗粒细胞依赖。对照小鼠鞘内呋塞米降低PWT提示生理状态下脊髓α6GABA_AR提供抗伤害保护，病理状态下内源性保护不足，PQ增强张力性抑制恢复调控。DK-I-56-1疗效与加巴喷丁相当且低剂量联合呈相加效应，可作为辅助治疔减少加巴喷丁类剂量限制性副作用，临床前显示无脱靶、无毒、无苯二氮?样副作用。综上，脊髓背角α6GABA_AR是纤维肌痛镇痛新靶点，α6GABA_AR选择性PAM如DK-I-56-1在两种模型中有效、无耐受、雌性更敏感，值得作为单药或加巴喷丁类辅助进一步研究。

研究结论部分翻译：本研究中，研究人员发现α6GABA_AR选择性正变构调节剂即两种PQ化合物，在ASI和ICS小鼠纤维肌痛模型中减轻了机械性异常痛和热痛觉过敏。这在两性中均发生，且雌性效力更强。与现有纤维肌痛药物对标时，其抗伤害效力不劣于现有药物。重复给药后，PQ显示强效抗异常痛效应且无耐受。PQ的抗伤害效应在Gabra6敲除小鼠中被消除，并被鞘内而非全身α6GABA_AR阻断所预防。这些结果表明，PQ通过脊髓表达的α6GABA_AR核心途径，减少两种纤维肌痛模型中的慢性广泛性伤害性反应。

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