双位（biparatopic）亲和体（affibody）工程实现高亲和力sortilin阻断与progranulin（PGRN）升高

《New Biotechnology》：Biparatopic affibody engineering enables high-affinity sortilin blockade and progranulin elevation

　　

progranulin（PGRN）基因的功能缺失突变是额颞叶痴呆（frontotemporal dementia）的常见病因，导致PGRN水平显著下降。因此，一种潜在的治疗策略是通过阻断sortilin介导的PGRN清除来提高细胞外PGRN水平。研究人员在此描述基于非免疫球蛋白亲和体（affibody）支架的小型双位（biparatopic）抗sortilin蛋白的系统设计与优化。两个抗sortilin亲和体分子通过基因融合构建了一组异源二聚体，探索了多种结构域取向、连接子长度和螺旋截断策略。总共生成并评估了十种不同的二聚体变体在结合与功能活性方面的表现。结构域排列与截断的优化使得构建体表现出亚纳摩尔级的sortilin亲和力，较最强的单体亲和体提升了约45倍，并显示出显著的亲合力（avidity）效应。在PGRN清除实验中，领先的18.6 kDa二聚体以0.32 nM的EC50值有效提高了细胞外PGRN水平，并产生比单体构建体显著更大的PGRN倍数变化。这种PGRN升高伴随着细胞表面及总sortilin水平的显著降低，与有效的受体阻断与调节相一致。综上所述，这些结果证明了系统性组合与几何优化两个中等亲和力的独立结合体如何产生高效的双位抑制剂，同时也说明了紧凑且模块化的亲和体分子作为治疗性蛋白设计构建单元的多功能性。鉴于越来越多证据表明sortilin参与神经退行性变、炎症和癌症，基于双位亲和体的抑制剂可作为研究工具与药物开发起点，在多类生物学背景下探索该通路。

该研究发表于《New Biotechnology》，围绕额颞叶痴呆（frontotemporal dementia）中progranulin（PGRN）单倍剂量不足导致的PGRN水平下降问题展开。目前针对GRN基因突变所致额颞叶痴呆的治疗选择极为有限，主要依赖症状管理。由于sortilin是PGRN清除的负调控受体，且PGRN的神经营养作用不依赖于sortilin结合，靶向sortilin阻断其介导的PGRN内吞成为潜在治疗策略。现有临床在研分子如IgG1 latozinemab和small molecule VES001虽显示安全性与PGRN升高潜力，但全长IgG格式无机制优势且引入Fc效应风险，替代支架蛋白尚未充分探索。研究人员基于此开展研究，利用小型模块化affibody分子进行双位（biparatopic）工程设计，旨在获得高亲和力sortilin阻断剂以有效提升PGRN水平，并验证affibody作为紧凑替代模态的可行性。研究得出结论：通过系统优化两个中等亲和力抗sortilin affibody的几何排列与截断，可获得亚纳摩尔级亲和力的18.6 kDa双位二聚体，其在PGRN清除实验中EC₅₀达0.32 nM，显著提升细胞外PGRN并降低细胞表面及总sortilin，证明双位工程可实现高效sortilin调制与PGRN稳态调节，为传统抗体方法提供紧凑模块化替代方案，对神经退行性疾病、炎症及癌症等多语境通路探索具重要意义。

研究人员为开展研究采用的主要关键技术方法包括：利用大肠杆菌BL21系统进行重组affibody构建体生产与纯化，采用表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）进行亲和力测定与分析，通过pH依赖性解离SPR实验评估内溶酶体途径酸性条件下的相互作用稳定性，使用小分子sortilin抑制剂AF38469进行阻断实验以定位表位，采用U-251 MG人胶质母细胞瘤细胞与PC-3人前列腺腺癌细胞进行哺乳动物细胞培养，通过流式细胞术分析细胞表面sortilin与构建体结合，利用PGRN清除实验结合ELISA定量上清PGRN水平，以及通过免疫印迹（western blot）分析总细胞sortilin表达变化。

3.1. An anti-sortilin affibody heterodimer displays avidity effects

研究人员将此前筛选出的两个抗sortilin affibody分子Z_Sort:A3与Z_Sort:G11基因融合为异源二聚体D0，并在SPR（surface plasmon resonance）中以ABD035捕获于HSA功能化芯片上分析。结果显示二聚体相较任一单体sortilin解离速率显著降低，表明存在亲合力效应与双位结合行为。

3.2. Systematic design of biparatopic affibody constructs

研究人员额外设计了九种ABD融合二聚体，变量包括连接子长度、结构域相对取向及Z_Sort:G11的螺旋3截断策略，其中D3为完全删除螺旋3（ΔQ⁴⁰–K⁵⁸），D4为部分删除（ΔA⁴⁶–K⁵⁸）以暴露C端双亮氨酸（dileucine）基序模拟PGRN C端QLL序列。

3.3. Biosensor-based affinity ranking of biparatopic affibody constructs

通过HSA捕获SPR筛选与三重复测定，所有二聚体均显示比单体更高亲和力；短连接子D2已足以产生强亲合力，提示两表位在sortilin上邻近；ABD-Z_Sort:A3-Z_Sort:G11取向最优；D3与D4截断无损害且D4亲和力达约5.5×10^?10 M，较最强单体提升约45倍。

3.4. Analysis of pH-dependent dissociation by surface plasmon resonance

在SPR中于pH 7.4、6.0、5.5、5.0下分析解离动力学。所有构建体在pH 5.0快速解离；单体在pH 5.5接近pH 5.0行为；二聚体D0与D2在pH 5.5解离略慢；D4在pH 5.5维持近似pH 6.0的动力学。AF38469阻断实验显示D3与D4受抑制，提示Z_Sort:G11表位与PGRN C端重叠，D4的C端LL可能参与结合。

3.5. Flow cytometric evaluation of on-cell sortilin binding

在U-251 MG（高表达sortilin）与PC-3（阴性）细胞中，以HSA-Alexa Fluor 647预孵育ABD融合构建体进行流式分析。所有抗sortilin构建体均结合U-251，二聚体信号高于单体；ABD-Z_Sort:A3-Z_Sort:G11取向二聚体（D0–D4）荧光显著高于其他取向二聚体，阴性对照Z_WT无结合。

3.6. Evaluation of PGRN clearance assay conditions

以U-251 MG为模型，测试1 μM构建体处理24、48、72 h。24 h胞外PGRN过低难区分，72 h因过度融合变异大，选定48 h。D0、D2、D4在1 μM下提升胞外PGRN程度与affibody-peptide融合体及latozinemab biosimilar相当，单体较低；同时细胞表面sortilin下降更显著于二聚体、融合体与latozinemab。

3.7. Dose-dependent PGRN clearance

在48 h剂量反应中，D4的EC₅₀为0.32×1.61^±1 nM，latozinemab biosimilar为0.28×1.63^±1 nM，优于D2（1.98×1.51^±1 nM）与Z_Sort:A3-PGRN_C15*（1.28×1.15^±1 nM）。D4最大PGRN倍数变化与对照相当。流式显示表面sortilin剂量依赖性下降，Western blot证实总细胞sortilin同步下降。D4与D0比对确认D4优越EC₅₀源于部分螺旋3截断及C端双亮氨酸而非连接子长度。

讨论部分总结：研究人员指出双位sortilin结合经SPR确认，优化二聚体亲和力达亚纳摩尔级，较单体提升约40倍；短连接子D2已显亲合力，说明两表位邻近；Z_Sort:G11螺旋3完全删除无损亲和力，与其在溶液中无序、可能以诱导契合或共折叠机制结合sortilin β-螺旋桨隧道一致；部分截断D4暴露C端双亮氨酸模拟PGRN C端QLL，其在PGRN清除中EC₅₀优势超过亲和力差异预期，可能与pH 5.5下较慢解离有关，影响内溶酶体途径中受体构象与转运。细胞实验中难以区分单位点双价结合与双受体桥接，但增强的表观亲和力与功能效力证明双位设计价值。观察到的约两倍PGRN升高处于单倍剂量不足矫正相关范围，与latozinemab biosimilar相当；latozinemab三期未达终点引发对sortilin靶向策略及PGRN下游效应的思考，包括PSAP介导内吞与细胞类型受体分布差异。除额颞叶痴呆外，sortilin与PGRN涉及阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、帕金森病等及癌症，具广泛意义。结论部分翻译：研究人员报道了具有强效PGRN升高特性的双位高亲和力sortilin结合融合蛋白的开发。值得注意的是，仅18.6 kDa的构建体D4（ABD035-G₄S-Z_Sort:A3-(G₄S)₃-Z_Sort:G11ΔH3*LL）展现出强效PGRN升高活性，伴随细胞表面与总sortilin水平降低，与受体的功能性调节一致。所构建体的小尺寸、易于制造与模块化设计代表相对于全长抗体的潜在优势，其架构允许整合额外功能模块，包括血脑屏障穿梭域，正如先前在其他affibody构建体与scFv中所做，或可与TfR-binding affibody结合设想。进一步理解这些基于affibody的双位sortilin结合蛋白对下游PGRN生物学的影响并在更具生物学相关性的模型中评估，将阐明其作为治疗候选物的潜力。