基于双向正交偏二乘(O2PLS)模型和细胞通讯揭示乳腺癌免疫微环境中调控因子的相互作用

《Cancer Medicine》：Revealing the Interactions of Regulatory Factors in the Immune Microenvironment of Breast Cancer Based on Two-Way Orthogonal Partial Least Square Model and Cell Communication

　　

免疫检查点抑制剂治疗并非普遍有效，且其疗效难以通过单一生物标志物预测。乳腺癌(BC)细胞在复杂的微环境中发展，该微环境包括肿瘤细胞、免疫细胞和细胞外基质，它们可能通过旁分泌信号相互作用。阐明BC中免疫微环境调控和细胞间相互作用的机制是筛选疗效标志物和开发新免疫治疗靶点的基础。基于免疫表型细胞浸润特征和转录组变化，研究人员构建了一个双向正交偏二乘(O2PLS)模型，以识别免疫细胞浸润(ICI)基因，定量表征BC内的免疫微环境，从而预测患者预后、选择免疫治疗敏感人群，并为免疫治疗与放疗和化疗的联合提供理论基础。研究人员描述了T细胞分化轨迹和细胞间通讯景观，并揭示了受体和配体(CXCL9-CXCR3、CCL5-ACKR1和GZMA-F2R)对免疫微环境和预后的协同效应。这些发现可能有助于阐明塑造免疫微环境的因素，并识别新的治疗靶点。

**论文解读**

**研究背景**
乳腺癌(BC)是女性高发恶性肿瘤，尽管综合治疗手段不断进步，但预后仍不理想，尤其在三阴性乳腺癌(TNBC)及复发/转移性BC中。免疫治疗，特别是针对程序性死亡受体1配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的抑制剂，为BC治疗带来了新希望，但仅少数患者获益。现有单一生物标志物（如PD-L1表达、肿瘤突变负荷(TMB)等）难以准确预测免疫治疗疗效。BC细胞在由肿瘤细胞、免疫细胞和细胞外基质构成的复杂微环境中发展，通过旁分泌信号相互作用。阐明免疫微环境的调控机制是筛选疗效标志物和开发新靶点的关键。为此，研究人员基于免疫表型细胞浸润特征和转录组变化，构建了双向正交偏二乘(O2PLS)模型，旨在识别免疫细胞浸润(ICI)基因，定量表征BC免疫微环境，以预测预后、选择免疫治疗敏感人群，并为免疫治疗联合放化疗提供理论依据。该研究发表在《Cancer Medicine》上。

**关键技术与方法**
1. **数据来源与预处理**：利用TCGA数据库（1091例BC RNA-seq及967例单核苷酸变异数据）、GEO数据库（GSE21653、GSE199633、GSE234519）及IMvigor210队列（免疫治疗数据），以及单细胞RNA-seq数据集GSE155109。
2. **免疫细胞浸润分析与表型划分**：采用CIBERSORT算法计算22种免疫细胞亚型浸润水平，并通过共识聚类将样本分为不同免疫表型。
3. **O2PLS模型构建与ICI评分计算**：以差异表达基因和免疫细胞浸润数据为输入，构建O2PLS模型，筛选出30个与免疫微环境最强相关的基因（ICI基因），并通过主成分分析(PCA)计算第一主成分作为ICI评分。
4. **单细胞分析**：使用Seurat进行细胞注释，monocle构建T细胞分化轨迹，CellChat分析细胞间通讯。
5. **受体-配体交互分析**：通过表面拟合和加性交互模型评估CXCL9-CXCR3、CCL5-ACKR1、GZMA-F2R对免疫微环境和预后的协同作用。
6. **体外实验验证**：包括免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down、免疫荧光、流式细胞术、Transwell迁移、细胞活力/凋亡/侵袭等实验，验证F2R与GZMA结合、ACKR1清除CCL5、CXCL9/CXCR3下游信号通路。

**研究结果**

**2.1 基于ICI的免疫表型鉴定**
通过共识聚类将BC样本分为Cluster A（高免疫浸润）和Cluster B（低免疫浸润）。Cluster A具有更高的免疫评分、基质评分，PD-1、CTLA-4、PD-L1表达更高，且无进展生存期更优，提示其对免疫治疗可能更敏感。

**2.2 基于O2PLS模型的ICI评分构建**
O2PLS模型解释了转录组数据39.3%的方差和免疫细胞浸润数据31.6%的方差，10折交叉验证Q2=0.76。筛选出30个ICI基因，计算ICI评分。高ICI评分与高免疫评分高度相关(R=0.92)，且与更好的总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)和无进展生存期(PFS)相关。免疫检查点标志物和免疫活性相关基因在高ICI评分组中过表达。

**2.3 ICI评分与分子亚型和临床特征的关系**
高ICI评分组与Cluster A对应，低ICI评分组与Cluster B对应。ICI评分在基底样亚型中最高，其次为HER2、Luminal A、Luminal B。TNBC、ER阴性、PR阴性样本的ICI评分高于相应对照组。多因素Cox分析证实ICI评分是OS(HR=0.57)、PFS(HR=0.63)和DSS(HR=0.56)的独立保护因子。

**2.4 ICI评分在治疗中的应用价值**
在TCGA队列中，高ICI评分组免疫表型评分(IPS)更高，对PD-L1/CTLA-4抑制剂更敏感。在IMvigor210队列中，高ICI评分组中PD-L1阳性肿瘤细胞2+级(TC2+)和免疫细胞2+级(IC2+)比例更高，完全缓解(CR)率更高。高ICI评分组对免疫治疗预后更好。低ICI评分组对放疗更敏感，而高ICI评分组从放疗中获益不显著，且ICI评分与放疗存在负交互作用(p=0.044)。化疗对两组均有保护作用，无交互。

**2.5 ICI评分与突变负荷、肿瘤干细胞性和免疫功能障碍的关系**
高ICI评分组具有更高的TMB、更低的mRNAsi（RNA表达基于的干细胞指数）和更高的功能障碍评分。ICI评分与TMB、mRNAsi弱相关，与功能障碍评分正相关，提示高ICI患者需免疫治疗调节失调的免疫功能。

**2.6 T细胞亚型鉴定和分化轨迹分析**
单细胞分析鉴定了11种细胞类型。CD4⁺和CD8⁺T细胞中，CXCR3表达在伪时间后期呈下降趋势，同时PD-1(PDCD1)和TIGIT表达上升，提示T细胞功能耗竭。

**2.7 细胞亚型间的细胞通讯**
免疫细胞与基质细胞间存在广泛通讯。CD4⁺/CD8⁺T细胞亚型间以MIF-(CD74+CXCR4)和MIF-(CD74+CD44)为主。T细胞亚型通过CCL信号通路作用于内皮细胞（CCL5-ACKR1主导），通过PARs信号通路作用于成纤维细胞（GZMA-F2R主导）。成纤维细胞主要输出信号，免疫细胞亚型主要输入信号。

**2.8 受体和配体对免疫微环境和预后的相互作用**
CXCL9与CXCR3在ICI评分和CD8⁺T细胞浸润上呈正加性交互，且对PFS有保护性交互。CCL5与ACKR1在ICI评分和CD8⁺T细胞浸润上呈负交互，高ACKR1表达抑制CCL5的预后保护作用。GZMA与F2R方面，高F2R表达抑制GZMA对PFS的保护作用。这些交互在GEO队列（GSE21653、GSE199633、GSE234519）中得到验证。

**2.9 F2R在癌症相关成纤维细胞(CAFs)上劫持GZMA驱动肿瘤免疫逃逸**
Co-IP和GST pull-down证实F2R与GZMA直接结合。免疫荧光和流式细胞术表明F2R表达水平与GZMA结合强度正相关。功能实验表明，CAFs以F2R依赖性方式中和GZMA，保护乳腺癌细胞活力、抑制凋亡，并促进迁移和侵袭。

**2.10 内皮细胞ACKR1通过清除CCL5抑制CD8⁺T细胞募集**
Transwell迁移实验显示，ACKR1过表达的内皮细胞显著减少CD8⁺T细胞向CCL5的迁移，而ACKR1敲低则增强迁移。ELISA证实ACKR1过表达有效清除CCL5，抑制剂可逆转此效应。

**2.11 CXCL9/CXCR3轴是驱动CD8⁺T细胞迁移的关键信号通路**
CXCL9呈剂量依赖性促进CD8⁺T细胞迁移，CXCR3抑制剂AMG487可显著抑制此效应。下游信号分析表明，PI3K/Akt通路起主导作用，MEK/ERK通路起辅助调节作用。

**讨论与结论**
**讨论总结**：本研究通过ICI评分定量表征BC免疫微环境，发现其独立于临床特征、突变负荷和TNBC状态，是预后保护因子，且与放疗存在负交互，提示免疫治疗敏感人群与放疗敏感人群可能相互排斥。三个受体-配体轴（CXCL9-CXCR3、CCL5-ACKR1、GZMA-F2R）在免疫调控中发挥关键作用：CXCL9-CXCR3通过PI3K/Akt和MEK/ERK通路协同促进CD8⁺T细胞募集；CCL5-ACKR1中，ACKR1通过清除CCL5破坏趋化梯度，抑制T细胞浸润；GZMA-F2R中，F2R阳性CAFs直接结合并中和GZMA，形成局部免疫逃逸。这些发现揭示了肿瘤微环境中免疫抑制的协同网络，为免疫治疗新靶点提供了理论基础。

**研究结论翻译**：在本研究中，研究人员基于与不同免疫表型相关的免疫细胞浸润特征和转录组改变，构建了O2PLS模型，以识别与乳腺癌免疫微环境最相关的30个基因，命名为ICI基因。这些基因包括免疫细胞标志物和微环境调控因子。由这些基因衍生的ICI评分有效量化了乳腺癌中免疫细胞浸润水平，并作为独立预后保护因子，与临床特征、突变负荷或三阴性状态无关，有助于识别可能从免疫检查点抑制剂治疗中获益的患者。值得注意的是，ICI评分在改善患者预后方面与放疗呈负交互，提示免疫治疗敏感人群与放疗敏感人群之间存在相互排斥关系，为联合治疗策略设计提供了重要见解。整合细胞通讯分析、转录组数据和临床特征，研究人员确定了三个关键受体-配体轴，它们在调控乳腺癌免疫微环境中发挥关键作用。CXCL9-CXCR3轴协同增强免疫细胞（包括CD8⁺T细胞）在肿瘤中的积累，在塑造整体免疫微环境中起关键作用，其正交互显著改善患者预后。机制上，CXCL9/CXCR3轴通过PI3K/Akt和MEK/ERK下游通路介导T细胞趋化，其中PI3K/Akt通路起主导作用。在CCL5-ACKR1轴中，高ACKR1表达抵消了CCL5的免疫细胞富集效应和预后益处。机制研究表明，ACKR1阳性内皮细胞通过清除CCL5削弱全身性T细胞招募信号。在GZMA-F2R轴中，高F2R表达抑制了GZMA的预后保护作用。实验验证证实，F2R阳性癌症相关成纤维细胞直接结合并中和浸润T细胞释放的GZMA，局部阻断其对肿瘤细胞的细胞毒性效应，从而构成一种新的肿瘤免疫逃逸机制。总之，本研究建立了一个定量表征乳腺癌免疫微环境并辅助指导免疫治疗策略的ICI评分。研究人员强调了三个受体-配体轴——CXCL9-CXCR3、CCL5-ACKR1和GZMA-F2R——在免疫微环境调节和患者预后中的协同作用。这些发现有助于阐明乳腺癌免疫微环境形成的机制，并为开发新型治疗靶点提供理论基础。