《Parasitology International》：Effects of F/2 medium variations on parasitic green microalgae Coccomyxa parasitica: Short-term morphofunctional adaptations
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摘要本研究探讨了俄罗斯株系的Coccomyxa parasitica在氮磷含量增加的F/2培养基中的短期形态功能反应及适应性变化。该菌株是从日本海采集的双壳类动物Modiolus kurilensis的感染组织中分离得到的。在为期七天的实验室培养过程中，研究人员分析了其生长动力学
摘要
本研究探讨了俄罗斯株系的Coccomyxa parasitica在氮磷含量增加的F/2培养基中的短期形态功能反应及适应性变化。该菌株是从日本海采集的双壳类动物Modiolus kurilensis的感染组织中分离得到的。在为期七天的实验室培养过程中，研究人员分析了其生长动力学、光合作用效率、细胞存活率以及功能参数。在2F培养基中，细胞密度在最初的48小时内迅速上升了60%。而在F和F/2培养基中，细胞数量几乎没有变化，但仍保持分裂能力。形态测量分析显示，细胞大小逐渐减小，这一现象在2F培养基中尤为明显。尽管2F培养基中的细胞会出现短暂的膜损伤，但其存活率在各种营养条件下始终保持在96%以上。值得注意的是，较高的叶绿素荧光水平与更高的线粒体膜电位以及较低的活性氧生成相关。这些结果表明C. parasitica具有很强的耐受营养波动的能力，说明其在不良环境下仍能通过有效机制维持生理稳态。
引言
Coccomyxa属包含多种常见的绿色微藻，包括淡水生、附生以及与高等植物和地衣共生的物种[1]。需要指出的是，这一属还包括多种海洋寄生种类，它们会感染海星、棘皮动物以及双壳类等无脊椎动物[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。Coccomyxa属的物种尤其会感染扇贝科和贻贝科的双壳类动物，比如马格ellan扇贝(Placopecten magellanicus)以及多种贻贝(Mytilus edulis、Mytilus galloprovincialis、Mytilus chilensis、Modiolus modiolus、Modiolus kurilensis)[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[8]、[9]。
这种寄生微藻最早是在20世纪70年代从纽芬兰附近的受感染P. magellanicus组织中发现的，如今它的分布范围已经大大扩展，从白海一直延伸到大西洋和太平洋，甚至包括俄罗斯远东地区的水产养殖区[4]、[8]、[9]。这类微藻会引发宿主严重的病理变化，比如贝壳变形、珍珠层受损、外套膜中出现珍珠状物、闭壳肌无力以及繁殖功能下降[3]。这些变化会削弱宿主的免疫功能，使其更容易受到二次感染，甚至可能引发大规模死亡事件[8]。目前尚未完全明确导致这些现象的机制，但现有证据表明，这种入侵过程是通过血淋巴实现的，同时微藻会在暴露在光照下的组织中定植[2]、[8]。
关于C. parasitica的生理特性，目前了解还十分有限。现有的研究大多只是基于标准条件下的长期培养观察得出的零散信息：从马陆贻贝M. kurilensis中分离出的C. parasitica的培养周期为40天，而作为弓蛤Anadara broughtonii内共生菌的C. veronica的培养周期则为89天。这些研究主要关注的是生长动态和基本形态特征，培养适应阶段通常持续6到14天[8]、[9]。迄今为止，只有一项针对加拿大株系（Coccomyxa sp. Metis-sur-Mer，KJ372210）的研究系统地分析了其生理可塑性，发现它对盐度、光照强度和pH值的变化具有很强的耐受性。不过，这些数据都是在指数生长阶段收集的，无法反映最初接触环境变化时的早期适应反应[11]。为弥补这一不足，我们设计了一项为期7天的短期实验，旨在探究高浓度的宏量元素和微量元素是否能够加速C. parasitica从滞后期进入活跃增殖状态。在通过18S rDNA基因片段的分子系统发育分析确认了该菌株的分类身份后，我们进一步研究了它在高营养浓度环境下的早期细胞和生理反应，包括活性氧水平、线粒体膜电位、叶绿素a荧光（作为光合作用活性的指标）以及细胞形态的变化。
内容节选
微藻菌株与标准培养条件
这种寄生微藻C. parasitica是从贻贝科的M. kurilensis中分离得到的。这些受感染的M. kurilensis是从日本海的彼得大帝湾中采集的，其软组织呈现出典型的绿色（见图1a、b）。
从受感染软体动物的组织中分离微藻细胞的方法参考了Sokolnikova等人的研究[8]。简而言之，我们从Modiolus物种的血淋巴和组织碎片中获取了微藻细胞。
系统发育分析
系统发育树是根据NCBI数据库中保存的63个Coccomyxa物种的18S基因片段构建的（见图2）。Coccomyxa属的分类体系相当复杂，系统发育分析显示其中存在多系群。同时，我们的样本与其他C. parasitica代表株的聚类程度达到了88%的bootstrap支持值，由此证明它属于该物种。
培养与形态特征分析
实验室批量培养的C. parasitica的适应期长达3个月。
讨论
氮和磷这两种关键宏量元素的浓度是决定微藻生长、生理功能和形态的重要因素。在本研究中，我们发现这种兼性寄生绿色微藻在短期培养的初始适应阶段（第1到3天），会对培养基中升高的营养浓度产生快速且灵活的生理反应，这一现象与之前长期培养研究观察到的滞后期相符。
结论
这是首次研究C. parasitica在短期暴露于高氮高磷环境中的情况。我们的研究结果表明，2F培养基中升高的氮磷浓度会暂时促进细胞增殖，之后细胞大小会缩小，生长速度也会随之下降。尽管出现了这些形态变化以及初始的渗透压应激，但细胞的存活率依然保持在96%以上，这一事实凸显了
CRediT作者贡献说明
Elina S. Chelebieva：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿、项目监督、项目管理、实验研究、资金申请、概念构思。Elizaveta A. Bogacheva：数据可视化、研究方法设计、实验研究、定量分析。Dariya S. Lavrichenko：实验研究、定量分析。Ekaterina A. Vodiasova：研究方法设计、实验研究、定量分析。Natalia V. Dantsyuk：研究方法设计、实验研究。Irina V. Drobetskaya：论文撰写——初稿、研究方法设计、实验研究。
资金支持
对Coccomyxa parasitica的功能和形态功能分析工作得到了RSF基金编号为24-26-20096的资助。基于18S rRNA基因序列的系统发育重建工作则是在国家项目编号126021016953–0的资助下完成的。这两个项目都是在俄罗斯科学院远东分院A. V. Zhirmunsky海洋生物学国家科学中心的“滨海水族馆”集体使用设施中开展的（位于俄罗斯符拉迪沃斯托克）。
致谢
作者们要感谢俄罗斯科学院远东分院A. V. Zhirmunsky海洋生物学国家科学中心的“滨海水族馆”（位于符拉迪沃斯托克）。同时也要感谢Marina Aleksandrovna Vashchenko博士、Maria Aleksandrovna Shulgina博士以及Anna Andreyevna Ponomareva博士，他们在帮助分离C. parasitica菌株方面给予了极大的支持和帮助。
Elina S. Chelebieva|Elizaveta A. Bogacheva|Dariya S. Lavrichenko|Ekaterina A. Vodiasova|Natalia V. Dantsyuk|Irina V. Drobetskaya|Ekaterina S. Kladchenko
俄罗斯莫斯科，俄罗斯科学院南方海洋生物学研究所A.O. Kovalevsky研究所
