《Phytomedicine》：Integrated Single-Cell and Network Analysis Identifies SLAMF7 as a Secretory Mediator of the Joint-Lung Axis in Rheumatoid Arthritis-Associated Interstitial Lung Disease Targetable by Tanshinone IIA
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摘要背景间质性肺病是类风湿关节炎最严重的关节外并发症之一。然而，介于关节炎症与肺部损伤之间的免疫纤维化介质尚未被完全阐明。天然产物作为多靶点治疗的潜在来源，其在类风湿关节炎相关间质性肺病中的治疗效果及机制仍不明确。目的本研究旨在识别与类风湿关节炎相关间质性肺病相关的关键免疫相关分
摘要 背景 间质性肺病是类风湿关节炎最严重的关节外并发症之一。然而，介于关节炎症与肺部损伤之间的免疫纤维化介质尚未被完全阐明。天然产物作为多靶点治疗的潜在来源，其在类风湿关节炎相关间质性肺病中的治疗效果及机制仍不明确。
目的 本研究旨在识别与类风湿关节炎相关间质性肺病相关的关键免疫相关分泌蛋白，并探索针对炎症-纤维化轴的潜在治疗化合物。
方法 我们利用来自类风湿关节炎滑膜组织、外周血单核细胞以及间质性肺病肺组织的转录组数据，进行了整合生物信息学分析。通过差异表达分析及加权基因共表达网络分析，确定了与类风湿关节炎相关的差异表达分泌蛋白以及间质性肺病的关键基因。进一步通过LASSO回归、支持向量机递归特征消除法以及独立类风湿关节炎相关间质性肺病数据集的外部验证，对这些候选基因进行优先排序。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析及功能富集分析用于确定共同的炎症程序并指导化合物预测。丹参酮IIA被选为优先进行实验验证的化合物。通过血清ELISA检测、胶原诱导性关节炎小鼠模型研究、组织学分析、流式细胞术、免疫荧光检测、单细胞RNA测序分析、巨噬细胞-成纤维细胞共培养、西方印迹试验以及细胞热位移试验，对这些分子及药理学发现进行了验证。
结果 SLAMF7被确定为连接类风湿关节炎相关分泌蛋白、间质性肺病相关关键基因以及类风湿关节炎相关间质性肺病差异表达特征的唯一核心基因，在该疾病患者中具有较高的血清水平且具备较强的诊断价值。网络分析显示存在一个以TNF、趋化因子及IL-17信号通路为特征的更广泛的炎症核心基因群，SLAMF7与该网络存在关联。丹参酮IIA被列为候选化合物，且与多个核心基因靶标具有良好的结合亲和力。在胶原诱导性关节炎小鼠模型中，丹参酮IIA能够减轻关节炎症状，降低循环中的炎症因子和促纤维化因子水平，下调SLAMF7的表达，同时减少肺纤维化及巨噬细胞浸润。单细胞RNA测序结果显示，SLAMF7在具有促纤维化转录程序的肺巨噬细胞中表达较高。体外实验表明，重组SLAMF7足以引发M2型巨噬细胞极化并激活CREB/C/EBPβ通路，而丹参酮IIA则能抑制这一反应。
结论 SLAMF7是一种潜在的生物标志物，也是连接类风湿关节炎相关炎症与纤维化的关键介质。丹参酮IIA可通过抑制炎症反应以及针对与SLAMF7相关的巨噬细胞-成纤维细胞轴，对关节及肺部病变发挥双重保护作用。
引言 类风湿关节炎是一种系统性炎症性疾病，大约有1%的人口患有此病。类风湿关节炎最常见的关节外表现是肺部受累，在疾病进展过程中，高达60%的类风湿关节炎患者会出现肺部问题（Akiyama和Kaneko 2022）。临床上，类风湿关节炎可引发多种肺部损伤，包括间质性肺病、支气管扩张以及胸膜疾病，且肺部受累通常发生在关节症状出现之后（Assayag等人2014）。尤其是类风湿关节炎相关的间质性肺病，会带来较高的发病率和死亡率。在类风湿关节炎早期往往无症状的阶段，气道黏膜及肺组织持续受损会引发先天免疫反应和炎症反应（Chen等人2021）。此外，类风湿关节炎特有的持续免疫刺激和炎症会加剧异常的纤维化反应，进一步损害肺部健康（Kadura和Raghu 2021）。
目前的理论认为，作为系统性炎症介质的分泌蛋白在类风湿关节炎多器官损伤的发生发展中起着关键作用（Doyle等人2014）。如果能找到在滑膜组织及血液循环系统中均出现异常表达的特定分泌因子，将为了解类风湿关节炎相关间质性肺病的发病机制提供重要线索（Doyle等人2015）。多组学整合技术以及机器学习算法（如LASSO和SVM-RFE）的最新进展，为从大量的转录组数据中筛选出这类核心调控因子提供了有力工具（Chen等人2015）。在本研究中，通过整合生物信息学分析方法，我们确定信号淋巴细胞活化分子家族成员7为类风湿关节炎相关的核心基因及关键分泌蛋白。SLAMF7也被称为CRACC、CS1或CD319，属于信号淋巴细胞活化分子家族。它作为一种自配体受体，能够与相邻细胞上的SLAMF7分子或游离形式的SLAMF7发生同源相互作用（O'Connell等人2022）。先前的研究表明，SLAMF7能够在不同环境下影响巨噬细胞的活化、吞噬作用、细胞因子产生以及极化状态（Simmons等人2022，Yuan等人2024）。重要的是，已在自身免疫性疾病患者的血液中检测到SLAMF7的游离形式sSLAMF7，而且它能够对表达膜结合型SLAMF7的免疫细胞发挥旁分泌作用（Kikuchi等人2020，Ishibashi等人2018）。SLAMF7兼具细胞表面标记物和分泌配体的双重身份，因此有可能成为连接类风湿关节炎关节炎症与远处器官病变的系统介质。不过，它在类风湿关节炎相关间质性肺病中的作用尚未被明确。
巨噬细胞极化在类风湿关节炎的发病机制中起着至关重要的作用，类风湿关节炎是一种以持续性滑膜炎和关节破坏为特征的慢性炎症疾病（Siouti和Andreakos 2019）。在类风湿关节炎中，巨噬细胞存在多种活化状态，大致可分为两种表型：经典活化巨噬细胞和替代活化巨噬细胞（Sun等人2023）。经典活化巨噬细胞具有促炎作用，能产生大量TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子，这些细胞因子会加剧类风湿关节炎的炎症反应和组织损伤。而替代活化巨噬细胞则具有抗炎和修复功能，能产生IL-10和TGF-β等细胞因子，这些细胞因子可能导致组织重塑和纤维化。值得注意的是，纤维化组织中的替代活化巨噬细胞具有促纤维化表型（Ge等人2024）。在肺纤维化过程中，肺泡巨噬细胞会向替代活化巨噬细胞表型极化，进而分泌IL-10、CCL1和TGF-β等促纤维化因子（T'Jonck和Bain 2023）。这些因子会刺激肺成纤维细胞的增殖和活化，导致细胞外基质过度生成，进而推动肺纤维化的发展。
丹参酮IIA是从丹参中提取的一种重要生物活性化合物，已有研究显示它在多种疾病中具有抗炎和抗纤维化作用（Wu等人2024，Xu等人2025，Feng等人2020）。不过，丹参酮IIA是否能够调节类风湿关节炎相关间质性肺病中与SLAMF7相关的免疫反应目前尚不清楚。总体而言，本研究旨在识别能够连接类风湿关节炎与间质性肺病的具有临床意义的分子介质，明确它们的免疫细胞背景及功能意义，并探索基于网络分析的类风湿关节炎相关间质性肺病治疗策略。在本研究中，我们结合了转录组分析、基于机器学习的筛选、临床验证、单细胞转录组分析以及在胶原诱导性关节炎模型中的实验干预，来研究SLAMF7在类风湿关节炎相关间质性肺病中的作用，并探讨丹参酮IIA的治疗潜力。
章节要点 差异表达基因的识别及整合基因特征分析 我们使用R语言中的“limma”软件包（版本4.2.0），分析了正常样本与类风湿关节炎样本（GSE55235，GSE100191）之间，以及正常样本与间质性肺病样本（GSE47460）之间的差异表达基因。差异表达基因的判定标准为|log2折叠变化值|大于0.585，P值小于0.05。与分泌蛋白相关的基因是从人类蛋白质图谱数据库中获取的（
https://www.proteinatlas.org/ ），最终得到了3946个基因列表（表S1）。通过维恩图可以
通过整合生物信息学分析识别类风湿关节炎相关分泌蛋白及间质性肺病关键基因 为探究类风湿关节炎与间质性肺病之间的分子关联，我们首先通过整合生物信息学分析方法建立了两组生物学上互补的候选基因集（图1A）。由于类风湿关节炎相关的肺损伤可能至少部分由循环或组织来源的炎症介质引起，因此我们重点关注在类风湿关节炎相关组织中表达异常的分泌蛋白。差异表达分析显示，类风湿关节炎关节组织中有2,491个差异表达基因（图1B，表S3），而类风湿关节炎外周血单核细胞中有3,017个差异表达基因
讨论 类风湿关节炎引起的肺部受累是一个复杂的现象，其形成与遗传、环境以及自身免疫因素有关，这些因素会导致肺泡壁和肺实质出现异常的组织反应（Matson等人2021）。越来越多的证据表明，引发类风湿关节炎发生的初始事件实际上可能发生在滑膜关节以外的部位。Zhang等人强调了IL-17在鼠肺纤维化中的作用，以及它与类风湿关节炎相关间质性肺病和特发性肺纤维化的关联，这为后续治疗提供了可能的方向
结论 综上所述，本研究通过整合生物信息学分析、临床验证以及实验研究，确定SLAMF7是类风湿关节炎相关间质性肺病中的关键免疫纤维化介质。SLAMF7会在炎症微环境中促进巨噬细胞的功能重编程，从而推动肺纤维化的发生发展。在此背景下，丹参酮IIA在两个层面展现出治疗功效：它能够在体内抑制炎症因子和促纤维化因子的作用，同时还能减弱与SLAMF7相关的
CRediT作者贡献说明 何轩：概念设计、方法学设计、实验研究、正式分析、数据整理、初稿撰写。何庆旭：验证工作及数据整理。卢亮晶：方法学设计、实验研究及正式分析。高健：研究监督、论文审阅与编辑工作以及资金筹集。
资金支持 本研究得到了国家自然科学基金的支持（项目编号：81973637，82373933）。
CRediT作者贡献详细说明 何轩： 初稿撰写、方法学设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念设计。何庆旭： 验证工作及数据整理。卢亮晶： 方法学设计、实验研究及正式分析。高健： 论文审阅与编辑、研究监督以及资金筹集。
利益冲突声明 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
何轩|何庆旭|卢亮晶|高健
