复方苦参注射液抗癌细胞作用靶点的验证

《Phytomedicine》：Target pathway validation for Compound Kushen Injection active against cancer cells

　　摘要
背景：中药是由多种天然产物混合而成，其作用机制具有多靶点特征。因此，寻找并验证这些靶点及作用机制一直是个挑战。在之前的研究中，我们以复方苦参注射液为模型药物，运用转录组学方法，识别出了多个通路及候选靶基因，这些靶基因是复方苦参注射液发挥药理作用的关键途径。

目的：本研究旨在阐明复方苦参注射液中天然产物在不同药理活性中的作用涉及的多重遗传靶点。

方法：本研究从四个候选通路中选出八个关键基因，利用CRISPR/CAS技术在这四种细胞系中敲除这些基因，以此验证它们在复方苦参注射液作用中的功能。

结果：尽管不同细胞系对基因敲除的敏感度存在差异，但总体而言，基因敲除会降低细胞的多种活性。加入复方苦参注射液后，除了CDKN1A基因敲除对药物效果影响较小外，其他基因的敲除显著影响了其在不同检测中的药理功效。其中，MYD88和NFkB基因的敲除提升了复方苦参注射液的功效。同时，我们发现IL24和CYP1B1基因在复方苦参注射液抑制肿瘤细胞迁移过程中起关键作用，而CYP1A1基因则对其诱导的细胞周期阻滞至关重要。

结论：这些研究结果进一步证实了我们之前转录组分析的结果，同时也展现了天然产物混合物多靶点协同作用的复杂药理机制。

引言
复方苦参注射液，又称阎术注射液，由苦参和白及两种中药材制成，属于依据传统中医理论制备的中药制剂（Lu等人，2024）。该注射液于1995年获得中国食品药品监督管理局批准，可用于多种癌症的临床治疗（Li等人，2023）。尽管有大量临床证据支持其疗效，但由于其配方较为复杂，其具体作用机制至今仍不明确。在之前的研究中，我们以复方苦参注射液作为传统中药制剂的模型，运用系统生物学和功能基因组学方法探讨其潜在的抗癌机制（Qu等人，2016；Shen等人，2019a）。研究发现，复方苦参注射液能够影响与癌症治疗相关的众多基因和通路（Aung等人，2019；Cui等人，2019）。这些结果表明，复方苦参注射液通过多靶点协同作用发挥功效，这也是中药的典型特征。不过，虽然我们已经确认了复方苦参注射液会干扰某些特定基因及其对应的蛋白质产物，但我们所识别的多数基因和通路仍需进一步验证。

基于之前的转录组分析结果，我们找到了四个受复方苦参注射液显著影响且在癌症生物学中具有重要意义的通路。随后，我们在每个通路上各选择两个基因进行敲除，以验证它们的功能。选择这些基因是因为在复方苦参注射液处理后，它们的转录水平发生了显著变化，且在其所属通路中具有重要的功能地位。我们所研究的基因如下：
细胞周期通路：CDKN1A、CDC14B
细胞因子-细胞因子受体相互作用通路：IL1A、IL24
NF-κB信号通路：MYD88、NFKB
细胞色素P450介导的外来物质代谢通路：CYP1A1、CYP1B1

值得注意的是，在MDA-MB-231和HepG2细胞系中，除MYD88外，其他所有基因在复方苦参注射液处理后均出现显著的上调现象（见补充图1）。这表明复方苦参注射液对这些基因的表达有显著影响，尤其是在这类癌细胞系中。为了比较不同物种间的差异并为未来的体内实验做准备，我们在四种细胞系中进行了基因敲除实验：人类来源的MDA-MB-231和A431细胞系，以及小鼠来源的B16F1和E0771细胞系。MDA-MB-231和A431细胞系曾用于我们之前的转录组分析实验，同时也是复方苦参注射液具有临床应用价值的肿瘤类型代表（Aung等人，2019；Cui等人，2019；Qu等人，2016；Shen等人，2019a）。B16F1和E0771则是相应的小鼠肿瘤细胞系，用于比较人类与小鼠肿瘤的反应情况，为未来的体内验证研究提供依据。

在癌症生物学领域，CRISPR/CAS技术被广泛用于探究肿瘤发生、进展及治疗反应的遗传机制（Chen等人，2019；Katti等人，2022）。此外，该技术还被用于研究各类癌症的耐药性，包括那些对化疗、靶向治疗及抑制剂产生耐药性的癌症（Gao等人，2021；Xing和Meng，2020）。在本研究中，我们运用CRISPR/CAS技术来验证与复方苦参注射液抗癌作用相关的候选基因和通路的功能，进一步探讨它们在复方苦参注射液多靶点作用机制中的作用。我们在四种不同的细胞系中分别对这八个基因进行了单独敲除，观察由此产生的表型变化以及细胞对复方苦参注射液处理的反应。研究发现，不同细胞系之间存在显著差异。但总体而言，这些基因的敲除会抑制细胞功能以及复方苦参注射液的作用。这些结果进一步验证了我们之前转录组分析所得的数据，同时也表明复方苦参注射液的抗癌作用是通过干扰多重通路和靶点而实现的协同作用，从而有助于我们更深入地理解其在癌症治疗中的作用机制。

材料与方法
复方苦参注射液的化学特性分析
在开展生物实验之前，我们首先通过HPLC–UV技术对复方苦参注射液进行了化学特性分析。我们选择了能够代表该注射液中两种中药材的标记化合物，并使用经过认证的参考标准对其含量进行测定。HPLC分析是在配备紫外检测器的Waters高效液相色谱系统中进行的（美国马萨诸塞州弗雷明汉市的Waters公司）。分离过程采用Waters XSelect CSH? C18色谱柱（250×4.6毫米，5微米）。流动相由以下两部分组成：(A) pH值用磷酸调节至3.0的0.2%磷酸-磷酸二氢钾水溶液，以及(B)甲醇。洗脱程序为：0–10分钟时，B相比例为3%；10–15分钟时，为3–5%；15–24分钟时，为5–15%；24–30分钟时，为15%；30–55分钟时，为15–85%；55–60分钟时，为85%；60–61分钟时，为85–3%，之后再经过3% B相的平衡阶段。流速为0.6毫升/分钟，柱温维持在30摄氏度，检测波长为211纳米，进样量为10微升。所有标记化合物的定量均使用经过认证的参考标准进行，其校准曲线在检测浓度范围内均表现出极佳的线性关系（R2=0.9998–1.0000）。我们根据相应的校准曲线对所选的标记化合物进行了定量分析。

细胞培养条件
MDA-MB-231细胞（美国弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC公司提供）和B16F1细胞（英国威尔特郡索尔兹伯里的ECACC公司提供）在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。A431细胞（ATCC公司提供）和E0771细胞（美国纽约州阿默斯特的CH3 Biosystems LLC公司提供）则在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。所有细胞均在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿式培养箱中培养。

质粒制备
我们在https://www.benchling.com/网站上，根据每个目标基因的信息，设计了位于选定外显子两侧的引导序列。编码这些引导序列的短DNA寡核苷酸由Sigma公司合成。这些合成的寡核苷酸在反应体系中退火，然后通过一步消化-连接反应连接到目标质粒上（Adikusuma等人，2017）。新合成的质粒被转染到DH5-alpha感受态细胞中（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司提供），随后将转染后的细胞接种到含有氨苄西林的LB琼脂平板上以进行筛选。我们会挑选出一到两个白色圆形菌落，将其接种到LB液体培养基中过夜培养和扩增。第二天，使用QIAprep Spin Miniprep Kit（荷兰芬洛的Qiagen公司提供）从感受态细胞中提取质粒，然后将其送往澳大利亚基因组研究机构进行Sanger测序，以确认引导序列已正确插入质粒。经过验证的质粒则储存在-20摄氏度环境中。

敲除细胞的转染与培养
对于质粒转染，我们使用了Thermo Fisher Scientific公司的Neon转染系统。在实际转染之前，我们会针对每种细胞系进行初步实验，以确定最佳的电穿孔参数，包括电压、脉冲宽度和脉冲次数。我们通过荧光显微镜观察不同参数下的转染效率。将质粒与细胞混合在100微升的电穿孔试剂中，然后进行电穿孔处理。转染后的细胞被转移到6厘米的培养皿中，继续培养48小时。

48小时后，用胰蛋白酶处理这些细胞，将其重新悬浮在流式细胞术缓冲液中。使用BD FACSMelody细胞分选仪（美国新泽西州富兰克林湖的BD Biosciences公司提供）筛选出发出绿色荧光的细胞，然后将这些细胞以每孔一个细胞的比例接种到96孔板中。该细胞板被放置在细胞培养箱中，我们每天使用显微镜观察并记录细胞的生长情况。一旦孔内细胞长满，就会将来自单细胞培养的细胞群收集起来，转移到更大的培养皿中继续扩增。

当细胞群长到足够大小时，我们会按照产品说明书使用QIAprep&CRISPR试剂盒（Qiagen公司提供）对部分细胞进行消化。接着，使用Mastercycler nexus梯度热循环仪（德国汉堡的Eppendorf公司提供）进行PCR扩增，以扩增目标区域。我们从扩增产物中挑选出分子量符合要求的片段，再使用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen公司提供）进行纯化，以去除杂质。纯化后的样本会被送往澳大利亚维多利亚州的澳大利亚基因组研究机构进行Sanger测序，以确认目标外显子已被完全敲除。

菌落形成试验
我们选取处于对数生长期的细胞，通过轻柔的吸管操作使其充分分散。统计细胞数量后，将细胞浓度调整至200个细胞/毫升，所用培养基中含有10%胎牛血清。将1毫升的细胞悬液接种到6孔板的每个孔中，然后再向每个孔中加入1毫升的完整培养基。将该6孔板放入细胞培养箱中，培养大约10天。当出现适当大小的菌落时，我们会吸出培养基，然后用PBS轻轻冲洗细胞。接着，将细胞与含有6%多聚甲醛和0.5%结晶紫的细胞染色溶液共同孵育30分钟，以实现细胞固定和染色。小心去除染色溶液后，将细胞在室温下风干。最后，我们统计6孔板中每个孔内含有50个以上细胞的菌落数量并加以记录。

细胞迁移试验
在本实验中，我们通过测量伤口闭合率来评估细胞在二维环境中的迁移能力。我们将细胞接种到96孔板中，培养至细胞密度达到90%融合状态。随后，我们将培养基更换为含有低浓度血清以及有丝分裂抑制剂5-氟-2′-脱氧尿idine（FUDR）的培养基，继续培养12小时。接着，我们使用真空装置在细胞板底部制造圆形或线形的伤口。之后，向伤口处加入低剂量的复方苦参注射液，或者仅加入含FUDR的空白培养基。在0小时时，我们使用配备了Canon EOS 6D相机的Olympus倒置显微镜（日本东京大田市的Canon公司提供）拍摄初始的伤口面积。在18–24小时时再次拍摄，以便比较伤口面积的变化，确保伤口尚未完全闭合。我们使用XnConvert软件对图像进行批量标准化处理，然后使用NIH ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院提供）对伤口面积进行量化，以便进行比较。

细胞存活率测定
我们通过细胞存活率测定来分析不同基因型的细胞对复方苦参注射液的敏感性。该测定方法是利用水溶性四唑盐生成橙色的甲酚蓝染料，从而量化活细胞的数量。根据初步实验结果，我们为每种细胞系选择了2–3种不同浓度的复方苦参注射液。我们将处于对数生长期的细胞消化后，用完整培养基将其浓度调整到所需水平。接着，将50微升的细胞悬液接种到96孔板中。过夜培养后，向每个孔中加入50微升含有相应浓度复方苦参注射液的完整培养基，继续培养24或48小时。为了检测细胞存活率，我们向每个孔中加入10微升的CCK8试剂（英国剑桥郡剑桥市的abcam公司提供），然后继续培养4小时。随后使用微孔板读取器在450纳米波长处测定吸光度。为排除背景吸收，实验中设置了不含细胞的对照孔。增殖比率是通过将含CKI处理孔的吸光度除以对照孔的吸光度来计算的。

细胞周期检测
我们选择了A431细胞系的所有基因敲除型，以及另外三种细胞系的CYP1A1/CYP1B1基因敲除细胞，用于细胞周期检测的验证。根据初步实验，我们对A431细胞系使用1/20稀释度的CKI处理，E0771细胞系使用1/15稀释度的CKI处理，而MDA-MB-231和B16F1细胞系则使用1/10稀释度的CKI处理。将适当数量的细胞接种到1毫升完全培养基中，置于六孔板中培养过夜。次日，加入含有相应浓度CKI的1毫升培养基，继续培养24或48小时。处理结束后，收集细胞并固定在冰冷的乙醇溶液中。用PBS清洗去除乙醇后的固定细胞，然后使用DNA提取缓冲液处理5分钟。随后，用含有核糖核酸酶的碘化丙啶溶液对细胞进行染色30分钟。染色后的细胞通过LSRFortessa流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析，数据则用FlowJo软件（TreeStar Inc., Ashland, OR, USA）进行处理和分析。

材料
Compound Kushen注射液（批号20210519）由中国山西省长治市的振东制药有限公司提供。标准品大黄胺、苦参碱、 Sophocarpine、 Sophoridine、 Oxysophocarpine、 Oxymatrine购自中国北京的国家食品药品监督管理局，鱼藤酸购自中国四川成都的Biopush公司，三叶草素购自中国广东深圳的QCSRM公司。T4 DNA连接酶试剂盒（型号M0202）、腺苷5’-三磷酸（ATP，型号P0756）、T4多核苷酸激酶反应缓冲液（型号B0201）、NEBuffer 2.1（型号B7202）以及BbsI酶（型号R0539）均购自美国马萨诸塞州伊普斯威奇的New England Biolabs公司。DL-二硫苏糖醇溶液（型号646563）、琼脂糖（型号A9539）、碘化丙啶溶液（型号P4864）、6%戊二醛（型号340855）、0.5%结晶紫（型号V5265）、牛胰腺来源的核糖核酸酶A（型号R5613）、5-氟-2′-脱氧尿苷（型号F0503）、牛血清白蛋白（型号A7030）以及TMB显色液（型号T0440）均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。DH5α感受态细胞（型号18265017）、Dulbecco磷酸盐缓冲液（型号14040133）、Cdc14B多克隆抗体（型号348900）、IL1a多克隆抗体（型号PA5-89037）、CYP1A1多克隆抗体（型号PA5-15213）、CYP1B1多克隆抗体（型号PA5-28040）、IL24多克隆抗体（型号PA5-102507）、MyD88多克隆抗体（型号PA5-19919）以及Vinculin重组兔单克隆抗体（型号42H89L44）均购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司。200bp DNA梯度条（型号GWS-DMW-200）购自澳大利亚南澳州Thebarton的GeneWorks公司。Midori Green Direct染料（型号MG06）购自德国北莱茵-威斯特法伦州杜伦的Nippon Genetics EUROPE公司。CDKN1A/P21：兔多克隆抗体（型号HA500156）购自美国马萨诸塞州沃本市的Huabio公司。NF-κB2 p100/p52：兔单抗（型号52583T）购自美国马萨诸塞州丹弗斯的Cell Signaling公司。

统计分析
所有实验均独立重复三次，每组有三个技术重复样本（N=3）。结果以均值±标准差的形式呈现。所有统计分析均使用适用于Mac OS X的GraphPad Prism 9.5.1版本软件（GraphPad Software, 加利福尼亚州圣地亚哥）完成。比较野生型细胞与基因敲除型细胞时采用了非配对学生t检验，p值用*标记（* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001；**** p<0.0001）。

结果
CKI的化学特性
在开展生物学实验之前，首先通过HPLC–UV技术对CKI批次进行了分析（图1）。共鉴定并定量了代表CKI中所含两种中药材的8种标志化合物。选择这些化合物是因为它们是CKI中已报道的主要生物活性成分，也被常规用作该制剂的质控标志物。大黄胺被确定为光果甘草的标志性成分，而苦参碱、Sophocarpine、Sophoridine、Oxysophocarpine、Oxymatrine、鱼藤酸和三叶草素则是黄连的代表性成分。这些标志物共同证实了本研究中所用CKI的典型化学特征及批次一致性。

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图1. Compound Kushen注射液的HPLC–UV色谱图。通过经过鉴定的参考标准物，对标记出的峰进行了鉴定和定量。

利用外显子缺失法制备基因敲除型细胞
在传统的CRISPR-Cas9基因敲除方法中，通常会删除目标基因外显子中约20个碱基对的序列，从而引发移码突变，导致该基因完全失活。但由于外显子长度或不同剪接变体的存在，选择合适的删除片段可能较为困难。在本研究中，我们使用了南澳大利亚基因组编辑中心及SAHMRI基因组编辑实验室的Paul Thomas教授提供的pDG458质粒。该质粒包含两个独立的外源DNA整合位点，可同时引入两个引导序列（Adikusuma等人，2017；Dangelmaier等人，2022）。对于每个目标基因，我们在目标外显子的两侧设计了引导序列，以此使整个外显子从基因组中完全缺失，并在下游外显子中引发移码突变，进而彻底使目标基因失活（图2a）。此外，由于删除的序列较长，可通过PCR初步筛选出成功被敲除的细胞系，随后通过Sanger测序（补充文件）和Western blot（补充图2）确认敲除结果。由于A431细胞对CKI的反应最为显著且重复性最好，因此被用于深入的机制分析，而其余细胞系则用于评估不同肿瘤模型中的基因型差异反应。

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图2. 基因敲除流程以及A431细胞的表型特征分析。（a）使用pDG458质粒进行的基因敲除过程。（b）WT型和敲除型A431细胞的存活率检测。（c和d）比较WT型和敲除型A431细胞系的集落形成能力。（e）比较WT型和敲除型A431细胞系的伤口愈合迁移能力。（f和g）比较WT型和敲除型A431细胞系的流式细胞周期分析结果。

A431细胞基因敲除后的表型变化
为确定基因敲除对各种细胞活动的影响，我们依次检测了A431细胞系的细胞存活率、集落形成能力、细胞周期分布以及细胞迁移能力。在A431细胞的CCK8细胞存活率检测中（图2b），24小时后的细胞增殖比率差异表明，IL1A、IL24和NFkB基因的敲除显著降低了A431细胞的增殖活性，而MYD88基因的敲除则促进了细胞增殖。集落形成能力检测的结果（图2c和2d）显示，CDC14B、IL24、NFkB和CYP1B1基因的敲除显著降低了单个细胞形成集落的能力，这一现象在IL24和NFkB基因敲除的细胞系中尤为明显，从固定染色的六孔板图像中便可清晰观察到。相反，CYP1A1基因的敲除则显著提升了细胞的集落形成能力（图2d）。此外，细胞周期分析表明，除了CDKN1A之外，其他基因的敲除均显著增加了细胞凋亡的比例，其中IL24、NFkB和CDC14B基因敲除的细胞系中这一增幅更为明显，这一结果与细胞存活率检测的结果一致（图2f）。不同细胞周期阶段的细胞比例也显示，如IL24基因敲除这类存在显著细胞凋亡的基因型，其G1期的细胞数量减少，而G2/M期的细胞数量增加，这表明细胞周期出现了停滞（图2g）。在细胞迁移能力检测中，A431细胞系表现出较高的迁移效率，几乎能在24小时内完全覆盖伤口区域（图2e）。大多数基因敲除型细胞的迁移速度仅有轻微提升，或与野生型细胞相比影响不大，唯有CYP1A1基因敲除的细胞系其迁移速度显著降低。

不同基因缺失对A431细胞对CKI反应的影响
为探究不同基因缺失对CKI作用的影响，我们首先使用细胞计数Kit-8（CCK8）检测法，评估了不同浓度CKI处理下A431基因敲除细胞系的细胞存活率。条形图（图3a）显示了在不同CKI浓度下，各基因型相对于未经处理的对照组而言的相对存活率，数值越低表示CKI的作用越显著。在A431细胞系中，几乎所有基因敲除型细胞系在经CKI处理后都与野生型细胞存在显著差异，且CKI的处理时间越长、浓度越高，这些差异就越明显。大多数基因敲除型细胞系对CKI的反应减弱，这说明这些基因的功能或其相关产物可能参与了CKI作用的调控。不过，MYD88和NFkB基因的缺失却增强了细胞对CKI的反应，这表明这些基因可能具有抑制CKI作用的功能。尽管如此，没有任何一种单一基因的敲除能够完全逆转CKI的作用。

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图3. 基因敲除对A431细胞中CKI作用效果的影响。（a）CKI处理下的细胞存活率检测（左为24小时，右为48小时）。不同条形代表CKI处理组与对照组之间的比率。（b和c）CKI处理下的伤口愈合迁移能力检测及迁移抑制程度的量化分析。（d和e）A431细胞系和MDA-MB-231细胞系中CYP1B1基因敲除后的迁移能力检测照片。

在之前的研究中，我们发现CKI能显著降低肿瘤细胞的迁移速率（Nourmohammadi等人，2019）。因此，在本研究中，我们进一步检测了CKI对不同基因敲除细胞细胞迁移能力的影响。在A431细胞系中，比较CKI处理组与对照组在不同基因敲除细胞系中的伤口愈合速率后可以发现，CKI显著降低了细胞的迁移速度（图3b）。然而，在IL24和CYP1B1基因敲除的细胞系中，这种差异几乎消失，这说明这两个基因在CKI调节A431细胞迁移能力的过程中起着重要作用。在MDA-MB-231细胞系的伤口愈合细胞图像对比中也能清晰观察到这一差异（图3d和3e）。进一步比较不同基因型中对照组与CKI处理组之间的细胞迁移速度差异后发现，MYD88和NFkB基因的敲除增强了CKI对细胞迁移能力的抑制作用，而除CDKN1A之外的其他基因敲除则显著削弱了CKI的这种作用（图3c）。

MDA-MB-231、E0771和B16F1细胞基因敲除后的表型变化
为比较不同肿瘤模型中基因型差异带来的表型反应，我们在MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞中进行了相同的检测。与A431细胞类似，基因敲除也改变了多种细胞表型，不过这些影响的程度在不同细胞系之间存在差异（图4）。在MDA-MB-231细胞系中，细胞周期通路相关基因CDKN1A和CDC14B的敲除导致形成的细胞集落数量显著减少（图4a）。CYP1A1和CYP1B1基因的敲除则降低了细胞的生长速度和迁移速率（图4c和f）。在生长速度快但迁移速率低的B16F1细胞系中，基因敲除对细胞表型的影响相对较小。MYD88基因的敲除显著提升了B16F1细胞的集落形成能力，而CYP1B1基因的敲除则加速了细胞的生长和迁移速度（图4b、d和g）。由于E0771细胞系的黏附能力较差，无法进行需要清洗和染色的集落形成能力检测。不过，一个有趣的发现是，这八个基因的敲除都显著降低了E0771细胞的迁移效率（图4h）。

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图4.MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞在基因敲除后的表型变化。(a和b)比较野生型与敲除后的MDA-MB-231和B16F1细胞系的集落形成能力。(c、d和e)比较野生型与敲除后的MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞系的细胞存活率。(f、g和h)比较野生型与敲除后的MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞系的细胞迁移能力。(i)与野生型相比，不同细胞系表型变化的热图。基于所有表型检测结果，我们制作了热图（图4i），以总结各细胞系敲除株的表型变化。从热图可以看出，总体而言，这些基因的敲除在多数情况下会减弱细胞活性。B16F1细胞系对基因缺失的敏感性较低，而E0771细胞系因基因敲除而出现细胞迁移能力显著下降。有趣的是，MYD88基因的缺失却在多个表型方面提升了细胞活性。不同基因缺失对MDA-MB-231、E0771和B16F1细胞对CKI反应的影响：我们对另外三种细胞系进行了细胞增殖和迁移实验（图5）。观察发现，与A431细胞系相比，这些细胞系在基因敲除后对CKI的反应差异不太明显。除了B16F1细胞系中CYP1B1基因被敲除以及E0771细胞系中IL1A基因被敲除后，它们对CKI的反应有所增强外，其余细胞的CKI活性均有所下降（图5a、b和c）。热图（图7a）直观展示了细胞存活率检测的结果。可以看出，大多数基因敲除株的CKI作用均有所减弱，这种变化在A431细胞系中更为明显，而MDA-MB-231和B16F1细胞系在基因敲除后对CKI的反应变化较小。此外，CYP1A1和CYP1B1基因的缺失还会改变各细胞系对CKI的反应。下载：下载高分辨率图像（844KB）下载：下载全尺寸图像图5. 基因敲除对MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞中CKI功效的影响。(a、b和c) MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞系在CKI处理下的细胞存活率检测（上图为24小时，下图为48小时）。不同柱状图代表CKI处理组与对照组之间的比率。(d、e和f) MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞系在CKI处理下的伤口愈合迁移情况（上图）及迁移抑制程度的量化分析（下图）。CKI在降低MDA-MB-231和B16F1细胞系细胞迁移速度方面的作用并不如在A431细胞系中那么显著（图5d和e），但显然大多数基因的缺失都会削弱CKI的作用。在MDA-MB-231细胞系中，与A431细胞系类似，IL24和CYP1B1基因的敲除会对CKI的作用产生显著影响，而CYP1A1基因的敲除则会增强CKI的作用（图3e和5d）。在B16F1细胞系中，除了IL24和MYD88基因的敲除会增强CKI对细胞迁移的抑制作用外，其他基因的缺失通常都会削弱CKI的作用（图5e）。E0771细胞系的结果则较为特殊，因为多个基因被敲除后，这些细胞在CKI处理下的细胞迁移效率反而上升了（图5f）。由于该细胞系的黏附性较弱，我们在实验过程中观察到CKI处理组中的悬浮细胞和细胞团数量显著增加。因此，看似细胞迁移速度上升的现象可能实际上是由于悬浮细胞重新附着在伤口处，从而产生的误判，其实只是细胞的随机分散。未来应通过3D细胞迁移实验来进一步研究这一现象，以排除其干扰。CKI处理对细胞周期的影响：根据细胞增殖和迁移实验的结果，我们选择了A431细胞系的所有基因敲除株，以及其他对CKI敏感的细胞系中CYP1A1和CYP1B1基因的敲除株，用于后续的碘化丙啶染色实验。图6显示了在CKI处理下，A431细胞系所有基因敲除株与对照组相比的细胞周期特征。在对照组条件下，各敲除株的细胞周期形态差异很小，但在CKI作用下则出现了明显差异。除了凋亡细胞的比例存在显著差异外，整体细胞周期特征也有所不同，尤其是G2/M期的细胞比例。例如，CDKN1A基因敲除株与CYP1A1基因敲除株相比，其细胞会在G2/M期发生周期停滞。通过对不同基因敲除株在CKI处理下凋亡细胞频率和G2/M期频率的变化进行汇总，发现 在A431细胞系中，MYD88基因和CYP1B1基因的敲除会显著增强CKI的作用，而其他基因的敲除则通常会削弱CKI的作用（图7b和c）。其他细胞系中CYP1A1和CYP1B1基因的敲除株也在CKI处理下接受了凋亡细胞比例和G2/M期比例变化的分析（图7d），其结果与细胞存活率检测的结果一致。下载：下载高分辨率图像（702KB）下载：下载全尺寸图像图6. 未经CKI处理（左）或经CKI处理48小时后（右）的野生型与A431细胞系敲除株的代表性流式细胞术细胞周期直方图。下载：下载高分辨率图像（709KB）下载：下载全尺寸图像图7. 细胞存活率检测和细胞周期分析结果总结，显示了不同基因型在CKI反应上的差异。(a) 与野生型相比，不同基因型在细胞存活率方面CKI功效变化的热图。(b) 不同A431细胞系敲除株在CKI处理下的凋亡率变化倍数。(c) 不同A431细胞系敲除株在CKI处理下的G2M期比例变化倍数。(d) 与野生型相比，MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞系中CYP1A1和CYP1B1基因被敲除后，凋亡率和G2M期比例的变化倍数。此外，表格还展示了细胞周期检测结果与细胞存活率检测结果的对比。在A431细胞系中，CDKN1A基因的敲除带来的影响最小，而MYD88和NFkB基因的敲除则在多个方面增强了CKI的作用。其余基因的敲除则会导致CKI的作用减弱（表1）。对于其他三种细胞系而言，CYP1A1基因的敲除会降低CKI的效力，而在B16F1细胞系中CYP1B1功能丧失会增强CKI的作用，但在另外两种细胞系中则会使其作用减弱（表2）。总体而言，细胞周期分析的结果与细胞存活率检测的结果一致，即敲除大多数目标基因都会降低CKI的效力。表1. 各种实验中不同基因敲除对A431细胞系CKI敏感性影响的总结（与原始细胞系相比）。空白单元格CDKN1A KOCDC14B KOIL1A KOIL24 KOMYD88 KONFkB KOCYP1A1 KOCYP1B1 KO细胞增殖CKI低↓↓↑↑↓↓细胞增殖CKI中等↓↓↓↑↑↓↓细胞增殖CKI高↓↓↓↑↑↓↓凋亡细胞比例↓↓↓↑↓↑G2M期比例↑↓↓↓↓↓↑细胞迁移↓↓↓↑↑↓↓↑表示CKI功效增强，↓表示CKI功效减弱。表2. 不同检测中CYP1A1和CYP1B1基因敲除对MDA-MB-231、B16F1和E0771细胞系CKI敏感性影响的总结（与原始/野生型细胞系相比）。空白单元格MDA-MB-231B16F1E0771空白单元格细胞增殖凋亡细胞比例G2M期比例细胞增殖凋亡细胞比例G2M期比例细胞增殖凋亡细胞比例G2M期比例CYP1A1↓↓↓↓↓CYP1B1↓↓↓↑↑↑↓↓↓↑表示CKI反应增强，↓表示CKI反应减弱。总之，我们利用外显子缺失技术成功构建了四种不同细胞系中8个基因的敲除细胞系，并通过多种实验阐明了它们的表型变化。此外，通过观察不同基因敲除后CKI作用的变化，我们证实了这些候选基因及其相关的信号通路在细胞对CKI反应中的作用至关重要。不过需要指出的是，单个基因的敲除并无法完全抵消CKI的药理作用。这一结果进一步支持了在中药方剂等天然产物复合物中存在多靶点协同作用的机制（Kumar等人，2026年）。讨论不同类型的肿瘤细胞在分子遗传学和受体表达谱方面往往存在显著差异，而这些差异又会影响它们的生理功能以及对治疗干预的敏感性（Holliday和Speirs，2011年；Masters，2000年）。在本研究中，不同细胞系对CKI的敏感性、基因敲除后的表型变化以及CKI的药理作用都存在较大差异。在两种人类细胞系中，属于三阴性乳腺癌的MDA-MB-231细胞系对这种药物的敏感性低于A431细胞系。为了获得类似的抗肿瘤效果，需要使用比处理A431细胞系更高两倍以上的CKI浓度，因为A431细胞系过表达表皮生长因子受体（Ullrich等人，1984年）。此外，在A431细胞系中，不同基因敲除株对CKI抗肿瘤作用的影响显著且一致，这凸显了多种基因和信号通路在CKI抗肿瘤作用中的关键作用。在MDA-MB-231细胞系中，基因敲除对CKI功效的影响没那么明显，但那些表现出显著影响的实验结果与A431细胞系中的结果一致。然而，在两种小鼠来源的细胞系中，除了其敏感性低于A431细胞系外，其结果也与人类来源的细胞系存在差异。这些差异表明，在开展中药等复杂化合物的药理实验时，需要特别考虑不同来源细胞系之间的差异。由于肿瘤细胞具有难以控制的增殖特性，与细胞周期通路相关的基因一直是癌症研究以及抗癌药物靶点研究中的重要研究对象。CDKN1基因编码P21蛋白，该蛋白在G1期起着调控细胞周期进展的作用（Barr等人，2017年；Kreis等人，2019年）。在人类癌症中，该基因常常出现功能异常。根据细胞所处的环境，P21蛋白既可以促进肿瘤发生，也可以抑制肿瘤发生（Shamloo和Usluer，2019年）。在MDA-MB-231细胞系中，敲除该基因会显著抑制细胞生长和集落形成。另一个被敲除的基因是CDC14B，它参与细胞有丝分裂的结束和DNA复制的启动。CDC14B过度表达可诱发癌变，而且已被证明能够与肿瘤抑制蛋白P53相互作用并使其去磷酸化（Bassermann等人，2008年）。敲除该基因会减少A431和MDA-MB-231细胞系的集落形成，并增加凋亡细胞的比例。此外，细胞周期通路也是CKI发挥细胞毒性作用的主要途径之一，它能导致肿瘤细胞出现显著的细胞周期停滞。转录组分析表明，CKI通常会下调细胞周期通路中的基因表达，从而抑制癌细胞的增殖（Qu等人，2016年）。根据之前的测序数据，在本实验中，这两种基因在CKI作用下会出现显著的上调。从本研究的表型结果来看，CDKN1A基因的缺失对CKI作用的影响相对较小，这可能反映了细胞周期调控通路的功能冗余性，也可能意味着CKI诱导的细胞周期停滞并非主要依赖于CDKN1A本身，而是涉及细胞周期通路内的其他调控机制，这与癌症生物学中关于CDKN1A/p21功能的复杂且依赖具体环境的描述一致（Manousakis等人，2023年）。相比之下，CDC14B基因的敲除在A431细胞系中始终会降低CKI的作用，并抑制癌细胞的迁移能力。这表明CDC14B可能是CKI在细胞周期通路中发挥药理作用的关键节点基因。细胞因子在肿瘤的发生、发展及治疗过程中发挥着重要作用。此外，细胞因子及其相关受体通路也是CKI调控作用极为显著的作用途径，这在我们之前的研究中有体现（Aung等人，2019年；Cui等人，2020年）。IL-1信号传导会诱导炎症介质的表达，包括IL-6和COX2，这些物质会促进恶性细胞的存活与增殖（Dmitrieva-Posocco等人，2019年）。在敲除IL1a后，我们观察到肿瘤细胞生长速度减慢，且CKI在皮肤癌细胞中的作用也有所减弱。不过这种效应相当明显，可能是由于外源性的IL1b起到了补偿作用。IL24是一种广谱抗癌基因，能够诱导肿瘤细胞发生凋亡或选择性毒性自噬，而CKI可增加IL24的表达水平（Menezes等人，2014年；Qu等人，2016年）。敲除IL24基因后，A431细胞系的细胞生长及集落形成均显著减少，同时CKI的作用也有所削弱。有趣的是，在该敲除株中，CKI对细胞迁移的抑制作用完全消失了。鉴于有研究表明IL24能够抑制癌细胞的侵袭与迁移，这表明CKI对IL24生成的促进作用可能是抑制细胞迁移的关键因素（Ramesh等人，2004年）。有意思的是，与其他表型变化相比，IL24敲除在细胞迁移实验中的效应更为显著。这说明CKI的不同药理作用可能涉及部分不同的下游信号传导机制。NF-kB基因编码核因子-κ-B这一转录因子复合物的某个亚基，该复合物是参与炎症及免疫功能基因表达的核心激活因子。MYD88在白细胞介素-1及Toll样受体信号传导通路中起着关键的信号转导作用，其功能在很大程度上依赖于NF-kB（Kang等人，2017年；Warner和Nú?ez，2013年）。当NF-kB信号传导被激活时，它能使细胞对化疗药物产生抗性，并抑制细胞凋亡。因此，细胞在CKI处理后这两个基因的表达上升，可能是一种自我保护机制，用以抵御CKI的细胞毒性作用。所以在敲除这两个基因后，CKI的作用显著增强，这一点在A431细胞系中基因敲除后CKI反应变化的总结中也有体现。MYD88作为连接细胞因子与细胞内反应的基因网络中的关键节点，已被证明在CKI的作用中发挥着重要作用（Shen等人，2019b年）。这说明多种由细胞因子介导的免疫相关通路也是CKI作用的重要靶点。在敲除MYD88或NF-kB后观察到的CKI敏感性增强，也表明激活炎症信号传导通路可能在一定程度上作为细胞对抗CKI诱发应激的防御或适应反应。敲除MYD88后观察到的细胞毒性作用增强，则说明激活MYD88/NF-kB相关的炎症信号传导通路可能在一定程度上作为细胞对抗CKI诱发应激的适应性或防御性反应。不过，仍需进一步的研究来全面评估CKI对免疫细胞以及整个机体的影响。有研究指出，肿瘤细胞中的细胞色素P450（CYP）酶活性常常会发生改变，这可能导致抗癌药物失效。已有研究显示，肿瘤内的CYP酶活性与这些肿瘤对化疗药物的响应程度之间存在显著相关性。例如，在多种类型的肿瘤中都检测到了CYP1B1亚型的过度表达，它会影响氟他胺、米托蒽醌、紫杉醇和多西他赛等抗癌药物的代谢过程（Rochat，2005年）。CKI作为一种包含数百种成分的复杂混合物，会在药物作用后诱导多种与代谢相关的基因表达上升。在本研究中，我们选择敲除CYP1A1和CYP1B1基因，因为之前的转录组分析结果显示这两种基因在CKI作用下表达显著上升。早期研究显示，与人肿瘤细胞中显著上调的CYP1B1不同，CYP1A1在人类肿瘤细胞中则显著下调（Li等人，2021年；Spink等人，1998年）。这些变化可能与促炎微环境对细胞的影响有关，这种影响会在一定程度上改变肿瘤细胞的生理功能。不过，这些效应在不同细胞系中并不一致。在CKI存在的情况下这些基因显著上调，可能是由于相关的小分子配体激活了AhR受体，但这还需要进一步研究（Kyoreva等人，2021年；Rannug，2020年）。在敲除这两个基因后，CKI的作用显著减弱，这一现象在人类A431和MDA-MB-231细胞系的多次实验中都得到了验证。这说明CYP1A1和CYP1B1产生的CKI代谢产物可能具有很强的药理活性。虽然我们的研究结果表明，敲除这两种代谢酶基因会对CKI的大多数药理作用产生一定程度的削弱效果，但敲除CYP1A1几乎完全消除了CKI的G2M期阻滞作用，而敲除CYP1B1则不会影响这一作用。此外，敲除CYP1B1几乎可以完全抵消CKI对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用，而敲除CYP1A1对此功能的抑制效果并不明显。这说明CYP1A1和CYP1B1产生的CKI代谢产物很可能是CKI的关键活性成分，分别负责诱导细胞周期阻滞和阻止肿瘤细胞迁移。这些发现表明，CKI成分的代谢处理可能直接为其药理活性发挥作用，或许是通过生成不同的下游生物活性代谢物来实现的。鉴于CKI的组成极为复杂，进一步的代谢组学及靶标识别研究对于明确具体的活性代谢物至关重要。另外，目前的研究是基于体外肿瘤细胞模型开展的，还需要在更复杂的生物系统及体内环境中进行更多研究来评估这些机制。更广泛的功能与机制研究也可能为揭示CKI活性的分子基础提供更多线索。

结论
综上所述，本研究基于之前的转录组分析结果，从四个通路中筛选出了八个关键基因，并在四种不同的细胞系中构建了相应的基因敲除模型。实验结果表明，敲除大多数选定基因都会对CKI的药理效果产生显著影响，从而验证了之前的基因分析结果，以及中医传统成分多靶点协同作用的机制假说。此外，我们发现IL24和CYP1B1基因在CKI抑制细胞迁移的作用中起着关键作用，而CYP1A1则对CKI诱导G2M期细胞周期阻滞非常重要。我们的研究结果显示，敲除这些基因几乎可以完全消除CKI的作用，因此为针对特定癌症类型研发个性化治疗策略提供了有希望的起点。总体而言，这些结果体现了CKI药理作用的多通路特性，也凸显了在研究复杂天然产物制剂时结合转录组学与功能遗传学方法的重要性。

伦理审批
不适用

作者贡献
Hanyuan Shen：撰写——初稿撰写、实验研究、定量分析、概念设计、数据整理。Saeed Nourmohammadi：实验研究、定量分析。Yan Zhou：实验研究。Yuka Harata_Lee：定量分析。Zhipeng Qu：定量分析。Wei Wang：资源提供。Andrea J Yool：撰写——审阅与编辑、研究指导。David L. Adelson：概念设计、撰写——审阅与编辑、研究指导。

资金支持
中医药特色国际合作项目（GZYYGJ2017035）

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未引用的参考文献
Kumar and Pravallika, 2026

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