早发性子痫前期胎盘中差异转录本使用

《Placenta》：Differential transcript usage in the placenta in early onset preeclampsia

　　

子痫前期是一种多因素妊娠疾病，以母体新发高血压和全身性内皮功能障碍为特征，源于胎盘病理学［1］。其他症状因患者而异，给早期检测带来挑战。尽管该临床综合征（是母体和胎儿发病率和死亡率的主要因素）已被认识一个多世纪，但其分子起源仍不完全清楚［2］，［3］。对受累胎盘进行的转录组学分析反复强调了血管生成信号［4］，［5］、氧化应激通路［6］和免疫调节［7］的紊乱。特别是，fms样酪氨酸激酶-1基因（FLT1），其编码膜结合血管内皮生长因子受体1（VEGFR-1）及其可溶性抗血管生成亚型sFLT1，已成为疾病发病机制的核心介质［8］，［9］。胎盘产生的sFLT1升高通过隔离VEGF和胎盘生长因子（PlGF）导致母体内皮损伤［10］。大多数子痫前期的转录组学研究集中于基因表达水平［11］，［12］，从而忽略了转录本使用改变。然而，人类胎盘表现出广泛的剪接可塑性，允许快速适应发育信号和环境应激源，如低氧［13］。这种转录后调控层可以影响蛋白质结构和功能，包括对胎盘血管发育至关重要的受体-配体相互作用。然而，尚未对选择性转录本使用对子痫前期分子景观的贡献进行系统探索。鉴于上述情况，研究人员着手利用高通量RNA测序来量化外显子-外显子连接覆盖率，并计算单个剪接连接的百分比剪接百分比（PSI）［14］。将剪接连接水平的全基因组分析应用于多个胎盘RNA-seq数据集，为揭示关键信号网络中的新型亚型调控提供了机会。特别是，VEGF受体家族成员代表了一个生物学上令人信服的系统，其中转录后变化可能重塑血管生成平衡。因此，当前研究旨在系统绘制妊娠并发早发性子痫前期（EOPE）与足月分娩（TB）或早产（PTB）对照胎盘中差异转录本使用（DTU）事件。通过整合独立队列的数据（图1A）并专注于外显子-连接动态而非总基因表达，研究人员的目标是定义患病胎盘的更广泛转录本使用结构，并识别转录本使用改变可能导致血管信号受损的分子通路。理解这些转录本水平的调控机制可能揭示胎盘病理生理学的新方面，并提出治疗干预的新分子靶点。

**论文解读：早发性子痫前期胎盘中差异转录本使用的研究**

**研究背景与问题**

子痫前期（Preeclampsia）是一种妊娠期多因素疾病，以母体新发高血压和全身性内皮功能障碍为特征，其病理根源在于胎盘功能障碍。尽管该疾病已被认识超过一个世纪，但其分子机制仍不完全清楚，尤其是转录后调控层面的改变。传统转录组学研究多聚焦于基因表达水平的差异，却忽略了转录本使用（Transcript Usage，TU）的变化，即通过选择性剪接（Alternative Splicing）产生不同mRNA亚型，从而影响蛋白质结构与功能。人类胎盘表现出高度的剪接可塑性，能够快速响应发育信号和环境应激（如低氧），但子痫前期中系统性转录本使用改变的研究尚属空白。因此，本研究旨在系统分析早发性子痫前期（Early-Onset Preeclampsia，EOPE）胎盘中差异转录本使用（Differential Transcript Usage，DTU）事件，揭示其病理机制并寻找潜在生物标志物。

**研究内容与结论**

研究人员利用四个公共RNA测序数据集（包括Awamleh、Yang、Ackerman和Barak队列，共238例胎盘样本：51例EOPE、40例PTB、147例TB）进行全基因组剪接连接分析。通过LeafCutter方法计算剪接连接百分比（Percent Spliced In，PSI）并比较组间差异。在EOPE与足月分娩（Term Birth，TB）的比较中，分别于Yang和Barak数据集鉴定出813和142个DTU事件，其中43个DTU在两个数据集中共同出现，且其ΔPSI值呈显著正相关（r=0.89，p=9.6×10^-29）。这些共同DTU基因富集于糖蛋白、细胞连接和细胞膜功能注释。为排除胎盘年龄（gestational age）的影响，研究人员比较了EOPE与早产（Preterm Birth，PTB）胎盘，发现仅有38个（Barak）和95个（Awamleh）DTU，其中4个共同DTU（TMEM45A、TPM1、CCDC183-RABL6 readthrough、INHA-STK11IP readthrough）均出现在EOPE-TB比较中，表明其与疾病状态相关而非胎龄效应。进一步，在43个共同EOPE-TB DTU中筛选出|ΔPSI|≥0.1的17个候选基因（排除受胎龄影响的LIFR、POSTN、RDH13），并通过独立队列（5例EOPE和5例TB胎盘）进行RT-PCR验证，确认FLT4、ADGRG6、MXI1和LCP1四个基因的差异剪接具有统计学显著性。

**主要技术方法**

1. **高通量RNA测序数据整合分析**：从NCBI GEO数据库筛选四个公共数据集（GSE114691、GSE148241、GSE203507、PRJNA914646），包括238例胎盘样本（51例EOPE、40例PTB、147例TB），来源于多个独立研究中心（如Awamleh、Yang、Ackerman、Barak等）。
2. **剪接连接定量与差异转录本使用分析**：使用HISAT2将reads比对至人类基因组（hg38），通过LeafCutter提取并计数剪接连接跨越reads（Junction Spanning Reads，JSRs），识别选择性剪接簇（LeafCutter cluster），以PSI值量化每个连接的比例，采用ΔPSI和校正p值（p.adjust ≤ 0.05且ΔPSI > 0.05）定义DTU。
3. **独立队列实验验证**：从Hadassah大学医学中心收集5例EOPE和5例TB胎盘活检样本，提取RNA后通过RT-PCR检测目标基因的转录本亚型比例，以GAPDH为内参计算PSI，采用t检验比较组间差异。

**研究结果**

**1. 早发性子痫前期的胎盘剪接特征**
基于JSRs，EOPE样本在PCA图中与TB和PTB样本分离。在Yang和Barak数据集中分别鉴定813和142个EOPE–TB DTU，其中43个为共同DTU，其ΔPSI值呈正相关，富集于糖蛋白、细胞连接和细胞膜相关基因。在EOPE–PTB比较中，仅38个（Barak）和95个（Awamleh）DTU，4个共同DTU（TMEM45A、TPM1、CCDC183-RABL6 readthrough、INHA-STK11IP readthrough）同时出现在EOPE-TB比较中，提示其与疾病相关而非胎龄。此外，已知子痫前期相关基因FLT1的剪接变化仅在Barak数据集中显著（ΔPSI 0.02–0.07），其外显子15（包含sFLT1剪接位点）的使用比例在EOPE中降低，且与胎龄呈正相关，与FLT1表达水平呈负相关。

**2. 早发性子痫前期剪接特征大部分不能归因于胎盘年龄**
比较TB与PTB健康胎盘（Barak数据集），鉴定95个PTB–TB DTU，其中30个同时出现在EOPE-TB DTU中，3个（SYNE2、RDH13、LIFR）为共同DTU，提示这些差异可能源于胎龄差异而非EOPE。

**3. 早发性子痫前期标志物筛选与验证**
从43个共同EOPE-TB DTU中筛选|ΔPSI|≥0.1的20个候选（17个基因和3个嵌合读通转录本），排除受胎龄影响的LIFR、POSTN、RDH13后，对MXI1、LCP1、RAPGEF2、FLT4、ADGRG6、AFDN六个基因进行独立队列验证。结果显示：ADGRG6（外显子跳跃增加，导致受体胞外区构象闭合）、FLT4（替代最后外显子使用增加，产生短亚型，缺失C端65个氨基酸，影响信号转导）、LCP1（下游AFE2使用减少，影响5'UTR调控）、MXI1（上游AFE1使用增加，产生MXI1-0亚型，可能调节内皮生长）四个基因的差异剪接达到统计学显著性。

**讨论与结论**

本研究首次系统揭示EOPE胎盘中广泛的差异转录本使用景观。通过多数据集交叉验证和独立实验验证，确认FLT4、ADGRG6、MXI1和LCP1的剪接改变与EOPE相关。FLT4短亚型（使用上游替代最后外显子）缺乏C端65个氨基酸中三个酪氨酸残基，可能削弱其信号扩增能力，与血管生成缺陷有关；ADGRG6外显子跳跃导致受体胞外区构象闭合，降低信号活性；MXI1-0亚型上调可能参与内皮重塑；LCP1的5'UTR变化可能影响其翻译调控。研究还发现，部分DTU（如TMEM45A、INHA-STK11IP readthrough）在EOPE与PTB比较中仍存在，表明其独立于胎龄，是疾病特异性改变。此外，研究人员注意到FLT1的剪接变化虽小，但因其表达水平显著升高，sFLT1/PlGF比值仍可作为分子标志物。研究还指出SRSF家族剪接因子（SRSF3、SRSF5、SRSF6）在EOPE中表达或剪接改变，可能参与DTU的调控。

**结论翻译**：总之，在子痫前期与非子痫前期胎盘之间鉴定的差异转录本使用事件可作为EOPE的分子生物标志物。其中几个改变的基因和通路先前已被涉及子痫前期，而其他代表值得进一步研究的新候选基因。综合来看，研究结果支持子痫前期表型源于血管异常和胎盘植入障碍的组合观点，并指出异常转录本使用是EOPE发病机制中一个被低估的贡献因素，从而提供生物标志物潜力和新的治疗途径。