拟南芥的基因组甲基化保守性与挥发性物质诱导的转录响应性相关

《Plant Gene》：Gene-body methylation conservation is associated with volatile-induced transcriptional responsiveness in Arabidopsis thaliana

　　摘要：绿叶挥发物能迅速触发与压力相关的转录反应，但决定其响应特性的基因层面特征仍不明确。DNA甲基化谱型可提供与表达范围、进化保守性及调控差异相关的稳定基因组注释。本研究重新分析了本团队先前针对7天大拟南芥幼苗在30分钟接触反式-2-己烯醛处理后所生成的RNA-seq数据集，并将其与Shahzad等人（2025年）的公开基因水平甲基化注释相结合。这些RNA-seq数据集包括Columbia-0（Col-0）、热休克转录因子A2功能缺失突变体（hsfa2）、组蛋白去乙酰化酶6突变体（hda6）以及天然品系Cvi-0。这四个品系均包含对应的非压力处理组和T2H处理组样本，其中Col-0和hsfa2还包含热应力处理组样本。这些甲基化数据并非来自经T2H处理的植株，而是作为现有的基因水平注释使用。对T2H有响应的基因在未甲基化、基因本体甲基化以及类转座子甲基化三类中分布并不随机。在基因本体甲基化的基因中，低或中等保守性的基因表现出更强的转录响应性，而高度保守的基因本体甲基化则对应相对稳定的表达特性。与甲基化相关的表达数量性状位点及表达变异注释进一步将挥发物响应性与天然的甲基化相关表达结构联系起来，同时确定了ATHSFA2、ATHSP101、AtFBS1、SARD1、DOGT1、AtC3H29、AtC3H47和AtBCS1等候选基因。这些研究结果表明，预先存在的甲基化结构会影响挥发物诱导的转录响应的强度和变异性，但并不意味着T2H会迅速重塑DNA甲基化模式。

引言：植物会面临多种环境压力，这些压力往往接连发生，而非孤立出现。短暂的热害、光照波动、食草动物侵害以及干旱等因素可能会相互作用，植物的存活往往取决于之前出现的非致命信号是否使其为后续压力做好了准备。这一准备过程通常被称为“启动”或“应力记忆”，可能涉及激素、氧化还原、蛋白质稳态以及染色质调控机制（Bruce等人，2007年；Conrath等人，2006年、2015年；Hilker等人，2016年）。在拟南芥中，由于热休克转录因子、下游分子伴侣系统以及与染色质相关的记忆机制已被广泛研究，因此热启动为理解应力记忆提供了有力模型（Charng等人，2007年；L?mke等人，2016年；Ohama等人，2017年；Friedrich等人，2021年）。不过，应力记忆也可能由化学物质和空气中的信号引发，这表明植物或许利用挥发物信息来预测环境恶化。挥发性有机化合物非常适合用于此类信号传递，因为它们能快速释放、在空气中扩散，并在植物内部或彼此之间发挥作用。植物挥发物参与生态相互作用，其在受伤、食草侵害以及非生物胁迫下的释放模式也会发生变化（Dicke和Baldwin，2010年；Holopainen和Gershenzon，2010年）。绿叶挥发物包括短链不饱和醛类及相关羰基化合物，它们是由氧化脂质代谢中的过氧化氢裂解途径产生的，在组织受损或面临环境压力时会释放出来（Matsui，2006年；Ameye等人，2018年；Matsui和Engelberth，2022年）。具有活性的绿叶挥发物反式-2-己烯醛能够诱导与热应激和氧化应激相关的基因的转录反应，其信号传导与WRKY转录因子、钙信号传导以及防御相关通路有关（Yamauchi等人，2015年、2018年；Mirabella等人，2015年；Aratani等人，2023年；Tanarsuwongkul等人，2024年）。具有活性的亲电性氧化脂质也能通过HSFA1转录因子激活类似热应激的转录反应（Muench等人，2016年）。先前的研究还表明，短暂的T2H暴露可提高野生型植株及染色质调控突变体的抗冻能力、激活与热应激相关的转录程序，并提升其耐热性（Barbaruah和Ito，2026年；Barbaruah等人，2026b年、2026c年）。挥发性物质响应的一个共同特点是，其与热休克反应网络存在部分重叠。在获得耐热性的过程中，A1类热休克因子会启动热响应，而HSFA2则有助于响应的放大、维持以及热记忆的形成（Nishizawa等人，2006年；Charng等人，2007年；Liu和Charng，2013年；Friedrich等人，2021年；Pan等人，2024年）。然而，挥发物诱导的启动作用并不等同于轻微的热启动作用。T2H能够在不升高温度的情况下激活与热应激相关的基因，同时还诱导与防御及氧化还原相关的转录程序。此外，即便早期HSFA2的诱导作用较弱或存在基因缺陷，挥发物诱导的胁迫保护作用依然可能发生（Yamauchi等人，2015年；Barbaruah等人，2026b年、2026c年）。尤其是拟南芥品系Cvi-0，尽管早期HSFA2的诱导作用较弱，但仍能保持挥发物诱导的耐热性，这说明挥发物信号传递会受到特定品系的转录调控背景的影响。因此，在本研究中，我们采用了统一的30分钟T2H处理作为干扰因素，以探究在不同遗传背景、品系以及染色质状态下，转录响应的差异。染色质状态很可能会影响这种响应性。热应激和应力记忆与组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、核小体动态的变化有关，在某些情况下还与异染色质松弛或转座子激活有关（Pecinka等人，2010年；L?mke等人，2016年；Perrella等人，2022年）。组蛋白去乙酰化酶参与应激响应性的转录调控，而组蛋白去乙酰化酶6与应激及防御反应密切相关。此外，HDA6还参与转录基因沉默，在拟南芥中与DNA甲基化及异染色质维持存在功能关联（Aufsatz等人，2002年；Probst等人，2004年；To等人，2011年；Liu等人，2012年）。在挥发性物质与热应激的背景下，hda6突变体仍能保持较强的T2H介导的耐热性，但其与热应激及活性氧相关的转录模块则出现定量上的重组，这表明HDA6有助于建立挥发物响应基因网络的基础状态和可诱导状态（Barbaruah等人，2026b年）。这些观察结果提示，挥发物响应基因可能受到预先存在的表观基因组特征的约束，而非在基因组中随机分布。基因本体甲基化为研究这一可能性提供了有效框架。在开花植物中，基因本体甲基化主要表现为转录基因本体内的CG甲基化，且通常与广泛表达且进化上高度保守的基因相关（Takuno和Gaut，2012年；Bewick和Schmitz，2017年；Zhang等人，2018年）。最近在拟南芥中进行的群体规模表观基因组分析将基因分为未甲基化、基因本体甲基化以及类转座子甲基化三类，同时还估算了不同品系间的基因本体甲基化保守性以及与甲基化相关的表达变异情况（Alonso-Blanco等人，2016年；Shahzad等人，2025年）。这些数据集为将甲基化状态视为与转录行为相关的有用基因水平特征提供了依据。在本研究中，我们将这一框架应用于挥发物响应性的转录分析。我们整合了此前在T2H响应研究中从Col-0、hsfa2、Cvi-0和hda6幼苗在对照条件及T2H处理条件下获得的RNA-seq数据集，对于Col-0和hsfa2，还整合了现有的热应力处理相关数据集。这些RNA-seq数据集均来自经过相同30分钟T2H处理或相应非应力对照处理的植物样本，且均已公开发布，具体信息见数据可用性说明及补充表S1。由于所有遗传背景都具备对照与T2H处理组的对比，因此将T2H响应性定义为主要的基因水平表型，而热应力则作为参考的转录程序。随后，我们利用公开的甲基化注释来确定对T2H有响应的基因是更倾向于与未甲基化状态、基因本体甲基化状态还是类转座子甲基化状态相关，基因本体甲基化的保守性是否与响应强度或缓冲能力相关，以及与甲基化相关的表达结构是否与HSFA2或HDA6依赖的响应相关。本研究并非仅仅列举受T2H诱导的基因，而是试图探究为何不同类别的基因在不同的生物学背景下会呈现不同的响应特性。我们假设，预先存在的甲基化结构决定了挥发物响应性转录行为的差异。根据这一模型，对T2H有响应的基因、对HSFA2敏感的基因、受品系特异性影响的基因以及对HDA6敏感的基因，应该会在按甲基化类型划分的基因类别中呈现非随机分布。如果能够证明存在这样的组织结构，那就意味着挥发物信号传递揭示了一种潜在的表观基因组框架，该框架影响着化学胁迫信息如何转化为转录响应。

实验材料与培养条件：拟南芥Columbia-0品系（Col-0；美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心编号CS60000）以及天然品系Cvi-0（编号CS1096）均来自拟南芥生物资源中心。在HSFA2比较实验中使用的热休克转录因子A2突变体为T-DNA插入系hsfa2（编号SALK_008978C）。用于染色质调控分析的组蛋白去乙酰化酶6突变体hda6（编号CS16399）也来自该生物资源中心。种子经过表面消毒后播种。

T2H响应性可作为基因水平的转录响应性状进行分析。我们首先围绕共享的非压力处理组与反式-2-己烯醛处理组之间的对比，对RNA-seq数据集进行了重新整理。通过对方差稳定后的表达值进行主成分分析，发现不同生物学重复样本形成了清晰的聚类，且根据基因型/品系背景以及处理条件的不同而有所区分，PC1和PC2分别解释了44%和24%的方差（见图1a）。这些结果表明，整合后的数据集仍能保持可重复的转录特征。

讨论：本研究采用了与以往T2H转录组分析不同的方法。先前的研究已经证实，T2H以及相关的活性挥发物能够诱导与热应激、冷应激、氧化还原应激、解毒应激及防御相关的基因表达，进而提升植物的耐逆性。在本研究中，我们试图探究为何这些响应在不同基因以及不同生物学背景下分布不均。通过将T2H响应性视为一种定量的基因水平性状，并结合公开的甲基化状态注释，我们发现……

结论：在拟南芥中，预先存在的基因本体甲基化特征与挥发物诱导的转录反应存在关联。将Col-0、hsfa2、Cvi-0和hda6在T2H处理下的RNA-seq响应数据与公开的全局甲基化注释相结合后，我们发现未甲基化状态、基因本体甲基化状态以及类转座子甲基化状态、基因本体甲基化的保守性、甲基化相关的表达数量性状位点状况以及天然的表达变异成分，都与响应的概率、响应的强度存在关联。

关于手稿准备过程中生成式人工智能及人工智能辅助技术的声明：在撰写本手稿时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来协助处理与编码相关的工作，以及解决RNA-seq数据处理和整合分析过程中遇到的问题。所有由人工智能生成的输出内容都经过了作者的仔细审查、验证和修改，作者对最终的手稿内容承担全部责任。在生成、修改或操控科学图表、图像数据或分析结果方面，均未使用任何人工智能辅助工具。

CRediT作者贡献声明：Baibhav R. Barbaruah：概念构建、形式分析、方法设计、数据整理、可视化处理、初稿撰写。Yuga Harada：审稿与编辑工作。Hidetaka Ito：概念构建、项目监督、资源协调、资金筹集、审稿与编辑工作。

资助情况：本研究得到了日本学术振兴会“挑战性研究（探索性）”项目资助（资助编号25K2243005），以及北海道大学的IGP项目的支持。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本论文研究成果的财务利益关系或个人关系。

致谢：作者感谢Ito实验室的成员们在讨论和技术支持方面给予的帮助。同时，作者也感谢北海道大学IGP项目所提供的支持。

Baibhav R. Barbaruah|Yuga Harada|Hidetaka Ito
日本北海道大学生命科学研究生院，札幌市060-0810