《Small Methods》：Red-to-Near-Infrared Fluorescence Resonance Energy Transfer Reporters for Dual Imaging Applications
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荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)生物传感器能够定量可视化活细胞中的蛋白质相互作用及信号转导动态。然而，大多数荧光蛋白(Fluorescent protein, FP) FRET对占据重
荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)生物传感器能够定量可视化活细胞中的蛋白质相互作用及信号转导动态。然而，大多数荧光蛋白(Fluorescent protein, FP) FRET对占据重叠的光谱区域，限制了多重分析以及同时成像多种通路的能力。特别是，表征良好的近红外(Near-infrared, NIR)受体可用性有限，制约了单细胞内的稳健双FRET测量。在此，研究人员表征了一对由mRuby2和miRFP670nano3组成的红到近红外FP FRET对。荧光寿命成像显微镜(Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)证明该对具有高效的能量转移、最小的光谱串扰以及与已建立的基于青色荧光蛋白(Cyan fluorescent protein, CFP)/黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein, YFP)的报告基因兼容性。与包括暗受体和长斯托克斯位移FP在内的替代性双FRET策略相比，该对在无需大量光谱解混或校正的情况下实现了多重成像。结构建模表明有利的供体-受体几何结构可能有助于其FRET效率。研究人员通过单细胞内Akt和S6K活性的同步FLIM-FRET成像证明了该红到近红外对的实用性，提供了PI3K-mTOR信号转导不同分支的并行读数。在三维侵袭实验中，Src和ROCK报告基因的双成像揭示了空间协调的信号转导动态，而这些动态在单报告基因测量中并不明显。总之，这些结果确立了mRuby2/miRFP670nano3作为FP-FRET工具箱中用于活细胞信号网络多重探询的实用补充。
该研究发表于《Small Methods》。当前基于荧光蛋白(Fluorescent protein, FP)的FRET生物传感器大多依赖CFP/YFP或GFP/RFP等可见光谱区变体，存在严重的光谱重叠、光毒性及可见光谱拥挤等问题，极大限制了多重或双FRET成像的应用。尤其是近红外(Near-infrared, NIR)受体的缺乏，使得单细胞内的双FRET测量难以稳健进行。虽然近期近红外FP工程有所进展，但红到近红外FRET组合仍缺乏充分表征与活细胞FLIM应用的验证。为突破传统光谱限制并实现信号网络的多重并行读取，研究人员开展了此项研究，旨在鉴定并验证一对高效的红到近红外FRET对，并将其应用于活细胞双成像及三维侵袭模型中的信号动态解析。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：利用荧光寿命成像显微镜(FLIM)进行时域荧光寿命检测与表观FRET效率计算；借助AlphaFold3服务器进行供体-受体对的蛋白质结构预测与相互作用表面面积、取向因子计算；采用溶剂可及表面积(Solvent accessible surface area, SASA)分析及时间依赖密度泛函理论(Time-dependent density functional theory, TDDFT)评估发色团跃迁偶极矩；使用PiggyBac转座子系统与慢病毒转导建立稳定表达FRET报告基因的细胞系（包括HEK293FT与MDA-MB-231细胞）；构建成纤维细胞收缩的三维胶原I基质模型进行活细胞侵袭成像；通过Western Blotting检测磷酸化水平验证报告基因敏感性；并运用泊松-玻尔兹曼方程求解静电势以分析蛋白电荷分布。
研究结果如下：
2.1 mRuby2 is an Effective Donor for Red-to-NIR FRET to miRFP670。研究人员通过在HEK293FT细胞中构建串联构建体，利用FLIM证实mRuby2与miRFP670之间存在显著的荧光寿命降低，表明高效的红到近红外能量转移。相比之下，mRuby3和mScarlet3与miRFP670配对时未检测到FRET。相对荧光强度评估排除了蛋白去折叠或失稳的影响。AlphaFold3结构预测显示mRuby2与miRFP670具有更大的相互作用表面面积（4.5 ± 1.2 nm2）及更高的预测取向因子（1.7 ± 0.8），表明更有利的供体-受体几何结构促进了FRET效率，而柔性连接子(GGGGS)?维持了瞬态接触的可行性。
2.2 Comparison to Previous Dual FLIM-FRET Approaches Highlights the Clear Advantages of mRuby2/miRFP670。研究人员将mRuby2与基于mTurquoise2/YPet的BioSrcT共表达，发现mRuby2寿命与强度均无显著变化，证明兼容性。对比暗受体ShadowG策略时，EGFP与ShadowG共表达导致供体通道寿命显著降低，源于受体发射的光谱串扰；长斯托克斯位移蛋白LSSmOrange与BioSrcT共表达亦引起强度和寿命扰动。而mRuby2/miRFP670对在实验条件下无检测到的通道间串扰，无需复杂光谱解混即可实现双FLIM-FRET。
2.3 Co-Expression of FRET Reporters for Both S6K and Akt Allows Tracking of Distinct Signaling Components of the PI3K Pathway。研究人员利用PiggyBac整合Eevee-S6K（mTurquoiseGL/YPet）及慢病毒转导Eevee-iAkt-FR（mRuby2/miRFP670）至MDA-MB-231细胞，实现单细胞内PI3K通路不同分支的同步监测。处理雷帕霉素（抑制mTORC1）和MK2206（抑制Akt）后，S6K与Akt报告基因分别呈现特异性FRET效率变化，与群体磷酸化水平（Akt Ser473、S6 Ser235/Ser236）改变一致。替换mRuby2/miRFP670保留了灵敏度但未改善膜定位缺陷，提示未来需优化红到近红外对电荷特性。
2.4 Dual FLIM-FRET of ROCK and Src Kinase in Invading Breast Cancer Cells Highlights Spatiotemporal Dynamics。研究人员基于Eevee骨架开发ROCK报告基因（底物MLC2/MYL2）及红移Src报告基因BioSrcFR，嵌入成纤维细胞收缩的三维胶原I基质中活体成像。结果显示ROCK活性呈现显著的前后循环（front-rear cycling），而Src活性在基线条件下稳定；抑制ROCK消除其循环并增加Src循环，抑制Src则不影响两者动态。通过归一化循环指数量化揭示信号层级：ROCK依赖性收缩性主导极性循环并约束Src动态，破坏ROCK后Src变得不稳定，彰显了双FLIM-FRET解析单报告基因无法观测的信号层级的能力。
总结讨论部分，研究结论部分翻译如下：
在本研究中，研究人员鉴定并验证了一对由mRuby2和miRFP670组成的红到近红外FRET对，并证明了其在二维和三维系统中用于活体双FLIM-FRET的实用性。研究人员表明mRuby2向miRFP670发生高效FRET，而密切相关的RFP无法支持红到近红外FRET。基于计算预测的蛋白质-蛋白质复合物，研究人员提出这反映了mRuby2更好地与miRFP670相互作用的能力，先前描述的FRET对似乎比较报道较差的FRET对形成更广泛的供体-受体相互作用的观察结果支持了这一点。既往研究已强调有意优化FP对间相互作用界面以提高FRET效率的效用。重要的是，该FRET对与现有的基于CFP/YFP的报告基因兼容，能够在无检测到的光谱串扰情况下实现双FLIM-FRET测量。利用此方法，研究人员在单细胞内同时监测了Akt和S6K活性，允许对PI3K-mTOR信号网络的独特分支进行并行探询。虽然S6K活性经典上与mTORC1相关，但也受mTORC2依赖性输入影响。因此，Akt和S6K的组合读数能够区分mTORC1和mTORC2相关信号转导，包括对雷帕霉素敏感和不敏感的mTORC2输出，这是单独使用单一生物传感器无法实现的路径分辨率水平。
遗传编码的FRET报告基因广泛用于探测活细胞中的动态信号过程，提供高时间分辨率和分子活性的定量读数。与FLIM结合时，这些报告基因提供浓度无关的测量，在异质或动态环境中尤其有价值。然而，对CFP/YFP或GFP/RFP变体的依赖限制了多重分析，并限制了其在体内或深部组织成像中的适用性，其中自发荧光、散射和光谱拥挤损害了信号保真度，而在应用NIR FP时可规避此问题。诸如高光谱FRET成像的替代方法可部分缓解光谱重叠，但需要专门仪器和计算解混。这些限制可通过使用NIR荧光蛋白减轻。
扩展这些NIR FP的应用，研究人员证明了其在三维细胞外基质中解析癌症细胞侵袭期间时空信号动态的使用。通过结合新开发的ROCK和Src活性FRET报告基因，揭示了单报告基因测量中不明显的独特动态行为。ROCK活性在侵袭期间表现出显著的前后循环，而Src活性在基础条件下保持相对稳定。扰动实验揭示了层级组织，其中ROCK依赖性收缩性控制极性循环并约束Src动态，仅在破坏ROCK信号转导后Src变得不稳定。总之，这些发现强调了利用多重FLIM-FRET同步通路监测如何能够解析在群体平均或单报告基因分析中被掩盖的信号层级和功能架构。
对于使用者而言，一个实际的考虑因素是mRuby2和miRFP670之间发色团成熟的差异。像mRuby2这样的GFP样RFP衍生自eqFP611，经历需要蛋白折叠、骨架环化、脱水和氧化的自催化发色团形成，报道的母体mRuby在37°C体外半衰期约2.8小时，mRuby2约150分钟。相比之下，miRFP670及相关蓝藻色素衍生的NIR FP通过共价结合胆红素IXα成熟，这是哺乳动物细胞中构成性可用的血红素分解代谢物。这种辅因子依赖性成熟机制报道的miRFP670nano半衰期约100分钟，不依赖于分子氧，因此对缺氧条件不如GFP样FP敏感。实际上，在标准细胞培养条件下，两种蛋白预计在表达几小时内基本成熟，成熟差异不太可能对稳态成像应用构成显著限制。然而，对于涉及诱导或脉冲追踪表达的实验，如追踪新合成蛋白池或监测快速信号事件，在解释FRET信号时应考虑mRuby2和miRFP670成熟间的动力学偏移，因为不成熟供体分子的瞬时群体可能混淆测量。
尽管取得了这些进展，进一步优化红到近红外FRET报告基因仍是一个重要目标。FRET传感器的动态范围最终受限于供体和受体的亮度、取向、相互作用和光稳定性。持续工程具有更高量子产额、减少电荷相关定位伪影和改善光物理特性的NIR荧光蛋白可能会进一步改善FRET效率和生物传感器性能。研究结果指出供体-受体相互作用是进一步优化的重点目标。以此方式，源自同一miRFPnano家族的紧凑NIR FP变体，如miRFP704nano和miRFP718nano以及其他替代性NIR受体，代表了在此背景下评估的有前景的候选者。此类发展可能产生具有增强动态范围和更广泛适用性的下一代红到近红外FRET对，用于体外和体内成像。
