Pl1对玉米基部叶鞘花青素生物合成的调控作用及其分子机制

《Plant Physiology and Biochemistry》：Regulatory effects of Pl1 on anthocyanin biosynthesis in maize basal leaf sheaths and the underlying molecular mechanism

　　

玉米叶鞘花青素积累受精确的转录调控，然而其关键调控因子和组织特异性着色的分子机制仍不完全清楚。通过基于EMS的诱变和CRISPR/Cas9验证，研究人员确定R2R3-MYB转录因子(TFs)Pl1而非B1，对叶鞘中的花青素生物合成是必不可少的。研究人员筛选了两个天然功能丧失Pl1等位基因，每个等位基因在mRNA的外显子3中均包含一个18-bp的缺失，该缺失可能源于富含GC序列介导的错位剪接。全基因组DNA亲和纯化测序(DAP-seq)揭示了8,053个高可信度的Pl1靶标基因，这些基因在精氨酸和脯氨酸代谢途径中显著富集。9个类黄酮途径结构基因被鉴定为Pl1的靶标，包括编码推定的细胞色素P450超家族蛋白的Zm00001d043174，该基因同时受bHLH因子R1的靶向调控。四个自交系的比较转录组学分析显示，相对于叶鞘，叶片中Pl1的表达受到组织特异性抑制。Pl1的过表达加深了叶鞘的着色并诱导绿色叶片着色。跨组织转录组比较鉴定了2,784个协同的差异表达基因(DEGs)，其中包括218个转录调控因子基因。通过Pull-down结合LC-MS(MS)分析两种组织中Pl1启动子结合蛋白，鉴定了61个转录效应因子，其中5个与协同DEGs重叠。这些效应因子编码AT-hook蛋白、一个DNA甲基转移酶、一个knotted同源框蛋白和一个新生多肽相关复合体亚基，被提出作为叶鞘特异性着色的候选上游调节因子。这项研究确立了Pl1作为叶鞘着色的主效调控因子，描绘了其下游靶标网络和候选上游因子，从而推进了对玉米空间限制性花青素积累的机制理解。

研究背景、问题与意义
花青素具有典型的C6-C3-C6骨架，在紫色玉米中以花青素苷、天竺葵素苷和芍药素苷衍生物为代表的色素占主导地位。花青素不仅具有色彩观赏价值，还在改善血管功能和脂质代谢等方面具有不可忽视的商业医药价值。在玉米中，花青素生物合成基因的激活需要R2R3-MYB和bHLH转录因子（TFs）的协同作用，分别由旁系同源基因家族C1/Pl1和R1/B1编码。这些调控因子以严格组织特异性的方式调节花青素的生物合成，然而玉米中“紫鞘绿叶”表型相关的空间限制性着色分子机制及其关键调控因子仍未被完全阐明。深入解析叶鞘特异性着色机制对于理解植物性状的空间分布特征和指导作物分子育种具有重要意义。为了明确玉米基部叶鞘中花青素积累的关键调控因子、其上游调节因子及下游靶标网络，研究人员开展了此项研究，相关论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》上。该研究确立了Pl1作为调控叶鞘着色的核心因子，并阐明了其调控网络，极大推进了对玉米花青素空间特异性积累机制的理解。

主要关键技术方法
研究人员使用来自玉米EMS突变体数据库的B1和Pl1的提前终止密码子突变体及B73、4F1等自然群体品系作为样本队列。研究主要采用CRISPR/Cas9基因编辑和过表达技术进行基因功能验证；利用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）和凝胶阻滞实验（EMSA）在全基因组范围内鉴定Pl1结合位点和靶标基因；运用高深转录组测序（RNA-seq）在4个玉米自交系中筛选跨组织一致性差异表达基因；最后通过DNA pull-down技术结合液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析鉴定与Pl1启动子结合的上游转录调控因子。

研究结果
Pl1编码了叶鞘基于花青素着色的调控因子：通过分析EMS诱变突变体发现，B1突变体的叶鞘仍积累花青素，而Pl1突变体叶鞘表现为绿色。这表明Pl1而非B1是调控叶鞘花青素积累的关键因子。
通过CRISPR/Cas9敲除和转基因过表达验证Pl1的功能：利用CRISPR/Cas9技术敲除Pl1导致玉米叶鞘变绿；过表达Pl1则不仅加深了叶鞘的着色，还诱导原本绿色的叶片积累了花青素。证实Pl1能正向调控玉米叶鞘和叶片的花青素积累。
在自然突变体中检测到Pl1 mRNA外显子3上的18-bp缺失：鉴定出4F1和JI63两个具有绿色叶鞘的天然突变品系。测序发现这两个材料的Pl1 mRNA外显子3中存在一个18-bp缺失，该缺失位于DNA结合位点下游13 bp处。推测富含GC序列形成的发夹结构干扰了转录或RNA加工，导致缺失并破坏了Pl1蛋白的功能。
Pl1靶基因的全基因组DAP-seq分析：鉴定出8053个高可信度Pl1靶标基因，富集于精氨酸和脯氨酸代谢途径。EMSA验证了Pl1能与多个基因启动子结合。进一步分析发现9个类黄酮途径结构基因为Pl1靶标，其中Zm00001d043174同时受bHLH因子R1靶向调控，提示其可能受R1-Pl1异源复合物的调节。
四个玉米自交系绿叶和紫叶鞘的比较转录组学分析：比较4个具有“紫鞘绿叶”表型的自交系转录组发现，叶片中Pl1的丰度显著低于叶鞘。鉴定出2784个在所有品系中均一致上调或下调的共同DEGs，这些基因主要富集于光合作用相关途径。包含218个潜在的Pl1转录调控因子。
基于Pull-down分析的筛选调控Pl1在叶片和叶鞘表达的转录因子：通过Pull-down结合LC-MS分析，鉴定出61个Pl1启动子结合的转录调控因子。与跨组织共同DEGs联合分析发现5个在所有自交系中均差异表达的核心候选上游调控因子，分别编码AT-hook蛋白、DNA甲基转移酶、knotted相关同源框蛋白和一个新生多肽相关复合体亚基，为组织特异性调控提供了候选机制。

讨论与结论
研究讨论指出，花青素积累在逆境防御中发挥重要作用。虽然此前研究表明B1和Pl1均与叶鞘着色相关，但各项CRISPR/Cas9与EMS突变体研究证据确凿地表明Pl1才是调控玉米叶鞘花青素生物合成的关键因子。天然突变等位基因中受富含GC序列的茎环结构影响产生的18-bp缺失破坏了Pl1高度保守的DNA结合域，进而丧失转录激活能力。

DAP-seq鉴定出的Pl1结合基序属于富含AC的序列，类似于已知的R2R3-MYB结合位点；类黄酮途径的9个结构基因包含这些结合位点。值得注意的是，Pl1靶标网络在精氨酸和脯氨酸代谢途径中的显著富集，结合此前紫鞘幼苗在盐胁迫下表现出较低活性氧积累的相关报道，提示花青素积累与脯氨酸代谢可能共同参与植物抗逆性调节，Pl1可能在其中发挥协同调控作用。通过钙转录组与Pull-down综合分析，研究人员锁定了5个核心上游候选调控基因，涵盖AT-hook蛋白和DNA甲基转移酶 2等。这些分子可能通过介导染色质重塑或DNA甲基化等方式，以组织特异性的模式精细调控Pl1的表达。该研究全面解析了Pl1调控玉米基部叶鞘花青素空间特异性积累的上游调控网络及下游靶标基因，确立了Pl1的主效调控地位。