通过氧化还原在电极上进行可编程和空间适形的工程化活体材料组装

《Small Science》：Programable and Spatially Conforming Assembly of Engineered Living Materials Onto Electrodes via Redox

　　

研究人员开发了一种电生物制造（electrobiofabrication）方法，该方法将明确的细胞/凝胶结构直接组装到电极上。为此，研究人员通过有目的地向聚乙二醇（PEG）和细胞组装溶液中添加二茂铁（Fc）氧化还原介体（redox mediator），并对电极施加氧化电荷，氧化交联了4臂硫醇化聚乙二醇（PEG）的末端硫醇。由于产生的二硫键在电极附近形成，交联的水凝胶组装由电极尺寸和施加氧化电位的时间决定。结果表明，介体浓度、输送的氧化电荷、组装溶液中的细胞数密度与随后的凝胶厚度和密度之间存在强正相关。在所有测试案例中，组装细胞（大肠杆菌）的存活率接近100%。研究人员进一步展示了一种重力介导的分层方法，以创建空间定义的界面，以及在几乎任意形状的各种导电材料上进行电组装。这些结果代表了一种电子或“可编程”组装细胞负载水凝胶的方法，使得能够进一步研究细胞-细胞相互作用、细胞-器件相互作用、生物传感、器件?生物通信，以及一些应用，如电遗传学（electrogenetics），其中细胞遗传电路通过使用氧化还原介导的通信模态施加电位来驱动。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
半导体技术推动了电子设备的小型化、低成本化和互联化，但将生物组件整合到电子系统中仍面临两大挑战：一是将脆弱的生物组件物理集成到功能电子系统中技术难度高；二是缺乏统一、高效、可扩展的电-生物通信方式。合成生物学虽能“重编程”细胞处理化学/生物信息，但如何实现生物与电子系统间的双向信息交换仍是瓶颈。本研究旨在解决第一个挑战，通过扩展先前开发的电生物制造（electrobiofabrication）方法，实现细胞和凝胶在电子平台上的可编程组装，并利用氧化还原介导的通信模态（即二茂铁，Fc）作为电子与生物之间的信息媒介，从而为后续的细胞-细胞、细胞-器件相互作用及电遗传学（electrogenetics）应用奠定基础。论文发表在《Small Science》。

**主要技术方法**
研究人员采用了一种基于氧化还原介导的电化学组装方法，在3D打印的光学透明氧化铟锡（ITO）电极平台上进行。关键技术包括：使用二茂铁（Fc）作为氧化还原介体，在电极表面氧化后催化硫醇化聚乙二醇（PEG）单体的巯基形成二硫键，从而交联成水凝胶；利用电极几何形状和施加电位的时间控制凝胶空间范围；通过重力沉降实现细胞分层；通过多次沉积和“固化”步骤构建多层结构。样本来源为实验室培养的大肠杆菌（DH5α-sfGFP和DH5α-dTomato）报告菌株，以及CHO细胞、酵母、藻类和假单胞菌等其他生物，未涉及临床队列。

**研究结果**

**2.1 细胞在PEG水凝胶组装中的包封**
通过施加不同氧化电位（0.2–1.0 V）和时长（60–180 s），发现当电位≥0.5 V时，细胞被成功捕获在PEG网络中，凝胶厚度和细胞分布均匀。电位0.2 V时无凝胶形成。细胞垂直分布呈钟形，峰值位于凝胶中部，且电荷累积曲线与凝胶形态高度一致，表明凝胶化的限速步骤与电荷相关，而非电位本身。

**2.2 受控的细胞分布**
在+0.8 V电位下，细胞荧光强度与沉积时间呈线性关系（R² = 0.97–0.99），且测量间的相对标准偏差低（0.77%–16.51%），表明方法高度可重复。凝胶厚度随时间先快速增加后减慢，与电荷积累的平方根相关（R² = 0.98）。单位电荷对应的细胞捕获量在近电极处较低，随凝胶向上生长而增加，提示近电极处交联密度更高。通过FITC标记的PEG和红色荧光细胞共沉积，证实细胞捕获与二硫键形成在空间上紧密对应。

**2.3 组装依赖于沉积时间、介体浓度和细胞密度**
改变Fc浓度（0.5–5 mM）和细胞密度（OD₆₀₀为1–6），发现凝胶厚度和细胞捕获量在Fc≥2 mM时显著增加，且与电荷积累正相关。低Fc浓度下，即使电荷增加，凝胶厚度仍有限，表明部分电荷被细胞相关氧化还原反应消耗。Fc浓度决定“能量密度”或氧化还原循环效率，从而控制凝胶形成和细胞捕获。

**2.4 外力（重力）影响组装细胞密度**
通过延迟施加电位（15 min沉降），细胞在凝胶中产生更明显的分层结构，钟形分布峰值向电极方向移动。初始细胞密度越高，沉降越慢（受阻碍沉降理论支持）。低细胞密度下，沉降时间越长，电极附近细胞积累越多，导致电荷输出降低（因细胞阻碍介体扩散）。荧光信号随沉降时间增加而增强（最高提升1132%），表明重力可大幅提高凝胶内细胞密度，但凝胶总厚度不变（约60 μm）。

**2.5 电化学“编程”提供结构**
通过“沉积-固化-再沉积”方法，在第一次沉积后对无细胞环境施加含Fc的氧化电位30 s，可“封闭”第一层凝胶表面，使后续沉积的绿色荧光细胞几乎不与红色荧光细胞重叠（仅有极窄黄色区域）。反之，不加固化步骤时，多层沉积产生更宽的混合区域（黄色带），且细胞垂直分布呈多个钟形峰。这表明通过控制固化步骤，可调节层间孔隙率，实现精确的界面控制。

**2.6 多种细胞类型在多种几何形状导电材料上的电组装**
在图案化ITO电极（棒棒糖形）上，依次沉积不同荧光细胞的水凝胶，无交叉污染。在石墨棒和金线圈上成功组装含细胞的PEG凝胶，荧光显微镜确认细胞均匀分布。此外，该方法同样适用于CHO细胞、酵母、藻类和假单胞菌，且细胞存活率及功能均保持。

**总结与讨论**
研究人员系统证明了Fc浓度、初始细胞密度、氧化电位、沉降时间及固化步骤对水凝胶组装的影响，并实现了在多种形状和材料电极上的可编程细胞/凝胶构建。所有组装细胞均保持功能（如表达荧光蛋白）和活性。通过“固化”步骤可创建低孔隙率界面，防止后续层细胞混入，从而精确控制多层结构。结论认为，该方法为在光学透明基底上创建细胞层提供了一种简单、可重复的方式，可用于研究细胞群体相互作用并装饰不同几何形状和材料的器件，在健康、能源和环境领域具有潜在应用价值。论文结论部分翻译如下：
“在本研究中，我们‘编程’了硫醇化PEG水凝胶的电组装，并将细菌细胞整合到各种几何形状和材料的电极上。结果显示，组装受Fc介体浓度、初始细胞数、所选氧化电位、自施加的沉降时间以及‘固化’步骤的应用影响。我们展示了可以创建多种垂直图案，且在所有情况下，细胞均保持功能（通过表达蛋白、消耗底物等指示）和活性。我们发现，第二次延长的‘固化’氧化步骤似乎创建了一个孔隙率较低的凝胶表面，阻止了后续层中组装细胞与第一层细胞的整合。总之，我们断言，在光学透明基底上创建细胞层，其中工程化细胞功能得以维持，为研究基于细胞的系统（包括不同群体的系统）以及用工程化活体材料装饰各种几何形状和材料的器件提供了一种简单且可重复的方式。我们相信这项工作将在健康、能源和环境领域找到应用，其中在多种指定几何形状中组装细胞使其能够进行详细研究并具有潜在应用价值。”