《Plant Science》：The nuclear-encoded plastid ribosomal protein bL31c of Arabidopsis thaliana functions in chloroplast biogenesis and leaf development
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质体核糖体由大(50S)和小(30S)亚基组成，每个亚基由核糖体RNA和质体核糖体蛋白构成。虽然许多PRP已经被表征，但仍有部分PRP的功能尚不明确。研究人员在拟南芥中采用反向遗传学方法，对目前尚无存活突变等位基因的核编码PRP基因进行功能表征。研究人员在此报
质体核糖体由大(50S)和小(30S)亚基组成，每个亚基由核糖体RNA和质体核糖体蛋白构成。虽然许多PRP已经被表征，但仍有部分PRP的功能尚不明确。研究人员在拟南芥中采用反向遗传学方法，对目前尚无存活突变等位基因的核编码PRP基因进行功能表征。研究人员在此报告了50S亚基PRP bL31c的表征结果。该基因RPL31此前被鉴定为胚胎发育所必需的基因(EMB2184)，但当时缺乏可存活的等位基因。RPL31是一个单拷贝基因，研究人员证实rpl31-1和emb2184（重命名为rpl31-2）互为等位基因。rpl31突变体表现出植株生长减缓、苍白、莲座叶呈锯齿状边缘的尖叶形态、叶肉细胞排列疏松且体积变小伴随叶绿体异常，以及子叶维管束模式受阻。使用RPL31pro:RPL31-GFP构建体证实了bL31c蛋白的叶绿体靶向性。RPL31功能丧失影响核基因和质体基因的转录本及蛋白积累，并改变rRNA丰度，这表明质体核糖体生物发生和/或翻译存在缺陷。值得注意的是，rpl31突变体表现出生长素活性标记物DR5pro:GUS和DR5pro:GFP表达模式的改变，以及生长素相关基因表达异常，并且对合成生长素2,4-D的敏感性降低。这些发现连同维管束和叶片形态的异常表明，rpl31突变体中生长素稳态受损。RPL31介导的叶片边缘发育依赖于CUP-SHAPED COTYLEDON2，rpl31-1突变与其他影响质体基因表达调节因子的突变具有协同作用。总体而言，研究结果表明，除胚胎发育外，RPL31在叶片形态建成中也发挥着关键作用，突显了其更广泛的发育学意义。
叶绿体是半自主细胞器，拥有自己的翻译机器。质体核糖体由大(50S)和小(30S)亚基组成，大多数质体核糖体蛋白由核基因编码。以往研究发现，PRP突变在多种植物中导致叶绿体生物发生、胚胎发生、光合作用及叶片形态建成等多方面缺陷。然而，部分核编码PRP由于胚胎致死性难以开展胚后发育研究。本研究在拟南芥中对编码50S亚基蛋白bL31c的单拷贝核基因RPL31开展研究。先前该基因被鉴定为胚胎发育必需基因(EMB2184)，但缺乏可存活的等位基因以探索其他功能。研究人员鉴定了可存活的等位基因并证实其存在剂量依赖性效应，发现RPL31不仅参与早期胚胎发生，还在胚后营养发育时期发挥关键作用。
研究人员采用了基于哥伦比亚-0(Col-0)生态型的拟南芥T-DNA插入突变体，样本队列包括SALK_091486(rpl31-1)和N16101(rpl31-2)等位基因突变系，并将其与cuc2-3、rif1-2、svr3-2及oz1等叶绿体缺陷型突变体进行杂交构建双突变体。主要关键技术包括：利用定量逆转录聚合酶链反应评估基因表达模式，通过高分辨率扫描共聚焦显微镜和透射电子显微镜观察细胞及叶绿体超微结构，借助免疫印迹分析光合蛋白丰度，运用Agilent Bioanalyzer系统量化核糖体RNA比例，并对构建有RPL31pro:RPL31-GFP载体的烟草叶片原生质体进行亚细胞荧光定位分析。
拟南芥rpl31突变体存在编码PRP bL31c的缺陷
研究人员通过反向遗传学筛选发现SALK_091486品系发生突变，表现出植株矮小、叶色苍白且边缘呈锯齿状。该突变被命名为crd3，测序表明T-DNA插入AT1G75350基因的3'非翻译区。同时，研究人员鉴定了emb2184等位基因，其T-DNA插入第二外显子导致胚胎致致死且部分配子体致死。将crd3与emb2184杂交后，F1代呈现比纯合crd3更严重的突变表型。通过表型与基因型分析证实两者为等位突变，将其分别重命名为rpl31-1和rpl31-2。通过向突变体中转化RPL31pro:RPL31-GFP构建体证明表型可被互补回复。
bL31c蛋白的生物信息学分析
序列比对显示拟南芥bL31c蛋白与多种原核生物同源蛋白仅在L31结构域区域高度保守。结构预测分析表明，所有蛋白均包含Ψ环和α螺旋结构。然而，与原核同源物相比，拟南芥bL31c蛋白具有延长的氨基和羧基末端，其中氨基末端延长归因于叶绿体转运肽序列的存在。
RPL31表达分析及bL31c蛋白亚细胞定位
生物信息学数据显示RPL31在子叶和幼嫩莲座叶中高表达。亚细胞定位实验中，激光共聚焦显微镜显示转基因株系叶片中的GFP信号与叶绿体自发荧光完全重叠，且原生质体瞬时表达同样证实该融合蛋白定位于叶绿体，证明bL31c为叶绿体靶向蛋白。
rpl31突变体的表型鉴定
相比野生型，rpl31-1/rpl31-1与rpl31-1/rpl31-2纯合或杂合突变体均表现出莲座叶面积减小且主根变短。色素测定发现突变体中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量显著降低，并导致光系统II(PSII)最大光化学量子产量F
v/F
m比值下降。此外，子叶维管束出现闭合失败等复杂度降低现象。叶片解剖显示叶肉细胞间隙异常扩大且难以区分栅栏与海绵组织，叶绿体内部结构严重破坏，类囊体肿胀且淀粉粒减少。
rpl31突变对叶绿体核糖体RNA积累的影响
RNA图谱分析表明，突变体中构成50S亚基的23S rRNA丰度显著上升，而细胞质25S rRNA水平下降。23S:18S与16S:18S rRNA比值升高，且16S:23S比值小于1，表明质体50S核糖体亚基生物发生或稳定性存在缺陷，且质体翻译受阻可能反馈影响细胞质核糖体组成。
rpl31突变体中核基因与质体基因的表达分析
RT-qPCR结果显示，核基因组编码的与质体基因表达相关的部分因子呈现上调，而典型的逆向信号传导标记基因RBCS1A表达被抑制。尽管质体基因psbA和rbcL转录水平升高，免疫印迹分析却表明其对应的D1和RbcL等蛋白丰度显著降低，表明质体翻译机制的受损使得转录积累无法转化为有效蛋白。
探讨bL31c功能与生长素的联系
由于突变体表现出锯齿叶缘和维管系统发育异常，研究人员检测了生长素相关系统。携带生长素响应报告基因DR5pro:GUS和DR5pro:GFP的rpl31突变体中报告基因强度减弱，且对合成生长素2,4-D的敏感性显著降低。此外，生长素生物合成及响应相关基因表达紊乱。构建rpl31-1与cuc2-3双突变体发现，锯齿叶缘被抑制，定量分析表明叶缘锯齿数量和面积均大幅下降，证明RPL31介导的叶边缘发育依赖于CUC2这一关键转录调控因子。
rpl31-1与其他叶绿体缺陷突变体的遗传相互作用
为深入探究bL31c的功能网络，将rpl31-1分别与rif1-2、svr3-2及oz1突变体杂交构建双突变体。结果表明双突变体均呈现出明显超越单突变体表型叠加的协同致死效应，其中rpl31-1 oz1双突变体极端白化且不能完成生活周期，证明RPL31介导的质体翻译机器与其他质体基因表达调控途径存在紧密的功能整合与协同。
讨论部分总结翻译了研究结论。研究结果表明，拟南芥RPL31基因由于其突变体表现出不同程度的等位基因剂量依赖性，在早期胚胎发生中以较高表达阈值为前提发挥着不可替代的作用，同时确保胚后发育顺利。bL31c定位于叶绿体内，作为50S核糖体大亚基的关键结构组成部分，基因突变破坏了核糖体正常装配及翻译延伸活性，触发针对质体功能缺陷的补偿机制并引发质体至细胞核的逆向信号传导。最终，RPL31丧失不仅造成光合器受损，导致严重影响光合性能，更会引起植物体内生长素稳态的改变从而调控叶片边缘形态与维管网络。本研究突显了PRP在植物叶片形态建成中跨越细胞器界限的重要意义，并支持质体翻译状态与生长素生物学途径在植物体内通过逆向信号存在功能交集的观点。本研究论文发表在《Plant Science》上，为理解核质协同控制机制提供了新视野。
