在拟南芥中，CAP1通过依赖RBOHD的ROS稳态来调节根毛对铵的反应

《Plant Science》：CAP1 regulates root hair ammonium response through RBOHD-dependent ROS homeostasis in Arabidopsis

　　

摘要

阐明铵离子（NH₄⁺）调控根系生长的分子机制对于缓解植物中NH₄⁺的毒性至关重要。拟南芥中的[Ca²⁺]_cyt-相关蛋白激酶CAP1可在NH₄⁺处理下调控根毛生长，而cap1-1突变体对NH₄⁺更为敏感，且活性氧水平升高。基于我们之前的磷酸化蛋白质组学数据，本研究探讨了呼吸爆发氧化酶同源物D（AtRBOHD）在NH₄⁺处理下对CAP1调控根毛生长的作用。通过酵母双杂交、双分子荧光互补、共免疫沉淀以及体外磷酸化检测，我们发现CAP1与RBOHD存在物理相互作用并使其磷酸化，其中Ser347是RBOHD上关键的磷酸化位点，对该相互作用至关重要。遗传互补实验表明，表达野生型RBOHD或其磷酸模拟变体（RBOHD^S347D）可部分恢复cap1-1突变体的根毛生长，并将NH₄⁺处理下的活性氧水平降至野生型水平。总体而言，我们的研究建立了一个机制模型：CAP1通过调节活性氧平衡，在Ser347位点磷酸化RBOHD，从而调控NH₄⁺依赖性的根毛生长。

引言

氮是植物生长所必需的营养元素。农业中广泛使用的氮肥包括硝酸盐、铵离子（NH₄⁺）和尿素。虽然大多数植物在低浓度（通常约为3mM）下以NH₄⁺作为主要氮源（Bijlsma和Lambers，2000），但高浓度的NH₄⁺会带来毒性。铵离子毒性的症状包括生长受阻、根冠比降低、根系结构改变以及叶片黄化（Bittsanszky等人，2015；Britto和Kronzucker，2002）。其背后的机制较为复杂，可能涉及根际酸化、细胞离子平衡紊乱、氧化应激加剧以及细胞质中NH₄⁺解毒的高能量消耗。目前对于NH₄⁺毒性的主要原因以及决定耐受性的关键性状仍无定论。因此，阐明NH₄⁺毒性的分子机制对于提高氮利用效率具有重要意义。

氧化应激是植物对NH₄⁺敏感性的典型表现，过量的活性氧会导致生长受到抑制（Esteban等人，2016；Li等人，2019；Liu和von Wiren，2017；Sun等人，2020）。活性氧在植物应对过量NH₄⁺的过程中起着关键信号分子的作用，而在高NH₄⁺处理下的植物中已发现有多种因活性氧水平升高而被激活的分子（Mittler，2002；Mittler和Blumwald，2015；Yang等人，2020；Zhuang等人，2019）。阐明活性氧平衡的调控机制有助于理解NH₄⁺毒性的形成机理。

植物根部是感知土壤中NH₄⁺毒性的主要器官，NH₄⁺胁迫会显著改变根系结构，尤其会影响主根、侧根和根毛的生长（Esteban等人，2016；Li等人，2010）。其中，根毛演化出了复杂的感应系统，能够通过调节基因表达、代谢活动及生长模式来帮助植物适应环境变化（López-Bucio等人，2003）。作为吸收养分和水分的主要部位，根毛对环境信号极为敏感。值得注意的是，高浓度的NH₄⁺会干扰根毛的发育，导致其结构异常且生长受阻（Bai等人，2014a；Bloch等人，2011）。

要阐明NH₄⁺毒性的机制，一种可行的方法是对响应NH₄⁺的突变体进行功能分析。我们之前的研究发现，属于长春花受体样激酶1样亚家族的[Ca2?]_cyt-相关蛋白激酶1（CAP1）是调控NH₄⁺依赖性根毛生长的关键因子。从培养基中去除NH₄⁺后，cap1-1突变体的根毛生长缺陷得以恢复（Bai等人，2014a）。CAP1缺失会导致顶端集中的细胞质Ca2?和活性氧梯度消失，进而阻碍根毛伸长，使其生长受阻（Bai等人，2014a；Bai等人，2014b）。不过，CAP1与NH₄⁺信号传导在调控根毛生长过程中的相互作用机制尚不清楚。

我们之前对野生型及cap1-1突变体在NH₄⁺处理下的高通量定量磷酸化蛋白质组学分析表明，AtRBOHD可能是CAP1的靶标蛋白，其Serine347位的磷酸化明显依赖于CAP1的作用（Yu等人，2022）。在拟南芥中，RBOH家族共有10个成员（RBOHA-RBOHJ），其中只有RBOHD的磷酸化会受到环境中的NH₄⁺浓度及CAP1功能的共同调控（Yu等人，2022）。RBOH家族在多种胁迫反应中都发挥着生成活性氧的关键作用，这些胁迫包括缺氧、缺水以及氮素缺乏等（Baxter等人，2014；Mittler等人，2004；Sagi和Fluhr，2006；Suzuki等人，2011；Torres和Dangl，2005）。

植物正常的根毛生长和发育需要一定水平的活性氧产生（Suzuki等人，2011）。为探究RBOHD在CAP1调控的NH₄⁺响应型根毛生长中的作用，我们发现CAP1会与RBOHD发生物理结合并使其磷酸化，其中Ser347位点对该相互作用及磷酸化过程至关重要。在cap1-1突变体中，转入RBOHD或其磷酸模拟变体RBOHD^S347D比转入磷酸缺失变体RBOHD^S347A更能有效缓解NH₄⁺引起的根毛生长抑制。此外，过表达RBOHD或RBOHD^S347D可显著降低cap1-1突变体中由NH₄⁺引发的活性氧积累，而转入RBOHD^S347A则对活性氧水平没有明显影响。

章节节选

植物材料与培养条件

所有实验均使用哥伦比亚-0生态型的拟南芥。T-DNA插入突变体cap1-1（SALK_083442）和rbohd（SALK_120299）来自拟南芥生物资源中心。种子先用20%（w/v）的次氯酸钠表面消毒10分钟，随后播种在添加了3%（w/v）蔗糖和1.2%（w/v）琼脂（pH 5.6）的MS培养基上。培养皿在4℃的黑暗环境中放置2–3天以打破种子休眠，之后垂直放置继续培养5–7天。

RBOHD在NH₄⁺诱导的根毛生长中起作用

在我们之前关于CAP1在NH₄⁺相关根毛生长中的作用机制研究中，高通量磷酸化蛋白质组学分析提示RBOHD参与了CAP1调控的NH₄⁺相关根毛生长过程（Yu等人，2022）。为研究RBOHD对NH₄⁺诱导的根毛生长的影响及其与CAP1的关系，我们首先分析了NH₄⁺处理对根毛生长表型的影响（图1a）。cap1-1、rbohd以及二者双突变体的根毛生长均出现

讨论

作为农业系统中最主要的氮源，NH₄⁺在植物生理过程中具有双重作用：在适宜浓度下对植物生长至关重要，但当浓度达到毫摩尔级别时则会产生毒害作用（Britto和Kronzucker，2002；Xu等人，2012）。越来越多的转录组学和生化研究结果表明，活性氧的积累是植物对NH₄⁺胁迫的典型反应特征（Esteban等人，2016；Li等人，2019；Liu等人，2022；Patterson等人，2010；You等人，2022）。尽管活性氧

资助情况

本研究得到了中国国家自然科学基金（31970198）、河南省自然科学基金（242300420137）以及中国国家自然科学基金（32400251）的支持。

作者贡献说明

王莲莲：方法学研究。杨洪：方法学研究。董一辰：方法学研究。白玲：论文撰写与编辑、初稿撰写、项目监督、软件应用、项目管理、实验研究、资金筹集、数据分析、数据整理。马晓楠：论文撰写与编辑、初稿撰写、实验研究、资金筹集、数据分析、数据整理。周云：数据分析、数据整理。陈庆斌：数据整理。杜佳顺：方法学研究。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

感谢刘文成教授提供PIP2A-mCherry载体。

作者贡献

白玲提出了该研究项目。杨洪负责表型测定、酵母双杂交实验、双分子荧光互补实验、共免疫沉淀实验、磷酸化检测以及转基因植物的构建工作。王莲莲参与了所有的共聚焦扫描和成像实验。董一辰负责表型测定和共免疫沉淀实验。杜佳顺、周云和陈庆斌参与了数据统计分析工作。马晓楠和白玲负责数据分析和论文撰写。所有作者都审阅并同意了最终版本的论文内容。

Hong Yang|Lianlian Wang|Yichen Dong|Jiashun Du|Qing-Bin Chen|Yun Zhou|Xiaonan Ma|Ling Bai

中国河南省开封市475004，河南大学生命科学学院，作物逆境适应与改良国家重点实验室