葡萄藤茎提取物可抑制采后苹果果实上的灰葡萄孢病菌

《Postharvest Biology and Technology》：Grapevine cane extract inhibits Botrytis cinerea pathogen on post-harvest apple fruit

　　

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  葡萄藤茎提取物在体外以及对分离的苹果果实上均能抑制灰霉病菌的生长。
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  该提取物具有预防作用，可减少苹果果实上的可见病斑。
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  葡萄藤茎提取物会扰乱灰霉病菌孢子的细胞器功能。
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  该提取物能够降低真菌的淀粉酶、木聚糖酶以及铁载体蛋白的活性。

引言

Botrytis cinerea Pers.是导致灰霉病的病原体，会给多种作物造成严重的产量损失。受感染的果实会被灰色菌丝覆盖，进而出现皱缩或腐烂现象（Billet等人，2020）。这种真菌属于子囊菌门，能够生活在多种植物表面及内部，它会分泌具有分解作用的水解酶和毒素，从而干扰植物的新陈代谢与防御机制（Sharma和Kapoor，2017）。它通过劫持植物酶的活性，在氧化爆发过程中产生羟基自由基，这些自由基有助于菌丝侵入植物组织，进而导致植物细胞死亡，部分原因是由于菌丝破坏了植物细胞的细胞壁（Bi等人，2023；Cantu等人，2008；Choquer等人，2007）。这类真菌不仅具备高效分解大分子物质的酶活性，还能有效代谢多种植物产生的防御化合物（Giménez等人，2023；Kuroyanagi等人，2022；Pedras等人，2011；Zimdars等人，2017）。它能够在从采收前（叶片、花朵和果实）到采收后储存的各个阶段，感染多种水果、蔬菜和花卉（Williamson等人，2007）。由于B. cinerea导致的腐烂果实和蔬菜需要被处理，这每年会给农业带来约100亿至1000亿美元的损失（Weiberg等人，2013）。

目前，限制B. cinerea侵害的最常见方法就是使用合成化学杀菌剂。然而，这种真菌具备很强的代谢适应能力，逐渐能够抵抗这类通常仅针对单一细胞靶点设计的非天然分子。因此，B. cinerea已经对苯并咪唑类、二羧酰亚胺类以及醌类杀菌剂产生了抗药性（Hawkins和Fraaije，2018；Leroux等人，2002；Shao等人，2021）。这就需要新的杀菌剂来应对这一难题。目前，人们通常会将不同类别的合成杀菌剂组合使用，或者将它们与不利于B. cinerea生长的栽培方法结合使用，以此既避免杀菌剂抗药性的出现，又能有效控制病害（Hawkins和Fraaije，2018；Shao等人，2021；Van den Bosch等人，2011；Yamaguchi和Fujimura，2005）。不过，这些措施仍然不够理想。最近，人们提出了多种控制B. cinerea的方法：其一，使用神经隐花碱衍生的吲哚喹啉生物碱这类酶抑制剂（Z24），它能够有效抑制番茄果实和黄瓜叶片上的B. cinerea生长（Zhao等人，2025）；其二，利用铜铁纳米晶作为过氧化氢生成剂，模拟植物中的超氧化物歧化酶，从而防止B. cinerea感染草莓果实（Liu等人，2025）；其三，利用从植物中提取的mRNA，通过细胞外囊泡将其传递到B. cinerea体内，这些mRNA会在那里被翻译成功能性蛋白质，进而降低真菌的毒力并阻止其感染（Wang等人，2024）。

在各类替代方法中，虽然植物酚类提取物作为天然杀菌剂在采后应用方面的成果不如化学杀菌剂显著，但它们依然拥有巨大的应用潜力（El Khetabi等人，2022）。已有研究探讨过植物提取物对采后果实上B. cinerea生长的抑制作用。例如，在Tetraclinis articulata开花期提取的精油，就能使番茄果实上的B. cinerea感染率降低64%（Rguez等人，2020）。在可食用植物中，大蒜Allium sativum L.的提取物也能抑制欧亚葡萄上的B. cinerea分生孢子萌发以及病害的发展（Gándara-Ledezma等人，2015）。

葡萄栽培技术以及用于食用或酿酒的葡萄生产过程会产生大量废弃物和副产品（如酿酒用的果渣、葡萄藤、砧木，以及季节结束后从葡萄园中清理掉的枝条），这些物质中含有丰富的酚类化合物（Benbouguerra等人，2021；Leifert和Abeywardena，2008；Xia等人，2014）。研究表明，葡萄藤茎提取物尤其富含芪类化合物（Gabaston等人，2017；Lambert等人，2013；Pawlus等人，2013；Rayne等人，2008）。参与植物病害防御的芪类化合物会在木质部中持续积累，而在病原体入侵时，它们也会在茎、叶和果实中局部产生并发生聚合反应。这类化合物可以通过多种作用机制发挥抗真菌作用，抑制多种植物病原体的生长（Ferreyra等人，2023）。富含芪类化合物的葡萄藤茎干和根部提取物，不仅能抑制B. cinerea的菌丝生长，还能延缓其漆酶的活性（Taillis等人，2023）。此外，用甲醇提取的Vitis vinifera葡萄藤枝条，在处理24小时后就能完全破坏B. cinerea孢子的细胞结构（Schnee等人，2013）。基于这些令人鼓舞的研究结果，我们测试了名为Antoferine?的葡萄藤茎提取物对B. cinerea的抑制效果，并发现了该提取物能够干扰B. cinerea的代谢功能。据我们所知，目前关于GVCE对采后果实抵御病原体的保护作用的研究还比较少。另外，真菌释放的水解酶和铁载体蛋白对于真菌获取养分和铁元素、实现自身生长至关重要，但GVCE对这些真菌水解酶活性以及B. cinerea分泌的铁载体蛋白活性的影响目前也尚未得到充分研究。

因此，我们的首要目标是确定GVCE在体外以及对分离的苹果果实上对B. cinerea的抑菌活性；其次，通过研究孢子萌发情况、孢子细胞器的完整性，以及GVCE对真菌酶活性和铁载体蛋白活性的影响，了解GVCE是如何抑制真菌生长的。要有效控制真菌的传播并预防其抗药性的产生，就必须更深入地了解天然杀菌剂对真菌的作用机制。

章节摘要

总体情况

所有用于培养真菌的溶剂、化学品、试剂以及培养基都直接从商业供应商处购买，无需进一步纯化。实验中使用的Milli-Q水来自纯化系统（Milli-Q，Synergy Merck Millipore，德国），使用前会进行灭菌处理。Switch?和Armicarb?分别由先正达公司（法国）和De Sangosse公司（法国）提供。

葡萄藤茎提取物的制备

提取流程如图1所示。我们在8月采集了黑皮诺品种的葡萄藤茎，将其放在室温下风干

体外抑菌活性

当GVCE的浓度从2.5克/升逐渐升高到10克/升时，B. cinerea的生长速度在96小时后逐渐减缓，而当浓度达到10–15克/升时，其生长速度出现明显下降（见图2）。当浓度进一步升高到15克/升到30克/升时，B. cinerea的生长则被完全抑制。该提取物的半数最大抑制浓度被测定为10.41克/升。

GVCE对B. cinerea的抑制作用，很可能源自其中所含的具有抗真菌活性的生物活性成分，比如trans-白藜芦醇等

结论

在本研究中，我们使用了通过水乙醇法提取的葡萄藤茎提取物（GVCE），且未进一步提纯以富集芪类化合物，检测了该提取物对苹果果实采后病原体B. cinerea的抑菌活性。在96孔板试验以及对分离苹果果实的试验中，该提取物都能通过干扰真菌孢子的萌发过程，以及影响孢子内的细胞器功能，从而抑制B. cinerea的生长。尤其是当GVCE处于亚致死浓度时，

作者贡献说明

Thi-Nga Nguyen：负责初稿撰写、实验研究以及概念构思工作。Bidel Luc P. R.：负责论文的审阅与编辑工作。Fanny Rolet：负责项目监督与管理工作。Eloise Ciordia：负责数据的形式分析工作。Christian Jay-Allemand：负责论文的审阅与编辑工作。Dorian Aznar：负责实验研究工作。Théo Descolat：负责数据的形式分析工作。Emilie Michellod：负责实验研究工作。Caroline Cayzac-Pfeiffer：负责实验结果的验证、项目管理以及方法学设计工作。Sylvain Schnee：负责论文的审阅与编辑工作，同时也参与了实验研究。

利益冲突声明

所有作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

我们要感谢Ferial Terki博士以及Quang-Hung Tran博士（PhyMedExp，UMR CNRS 9214 – Inserm U1046，地址：法国蒙彼利埃Cedex 05，邮编34295），他们帮助我们使用显微镜拍摄了孢子萌发的图像。

Thi-Nga Nguyen|Caroline Cayzac-Pfeiffer|Sylvain Schnee|Emilie Michellod|Dorian Aznar|Théo Descolat|Eloise Ciordia|Christian Jay-Allemand|Luc P.R. Bidel|Fanny Rolet