《Poultry Science》：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats?Associated Protein 9 (CRISPR-Cas9) Based Genome Editing in Avian Primordial Germ Cells: Comparative Technologies, Translational Applications, and Regulatory Challenges
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原始生殖细胞（PGCs）是禽类物种中进行可遗传基因编辑的独特平台，因为它们易于分离、培养，并可重新导入宿主。CRISPR/Cas9技术通过靶向编辑与生产、健康、繁殖和福利相关的基因和性状，推动了禽类基因组编辑的发展。本综述批判性地评估了禽类PGCs中的基因组编
原始生殖细胞（PGCs）是禽类物种中进行可遗传基因编辑的独特平台，因为它们易于分离、培养，并可重新导入宿主。CRISPR/Cas9技术通过靶向编辑与生产、健康、繁殖和福利相关的基因和性状，推动了禽类基因组编辑的发展。本综述批判性地评估了禽类PGCs中的基因组编辑工具，包括CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）、碱基编辑和先导编辑。研究人员比较了种系传递效率、适用性、精确性和可遗传性。评估了递送策略（包括病毒载体、电穿孔和核糖核蛋白的使用）的效率、细胞毒性和转化可行性。这些技术在鸡中的应用包括通过肌生成抑制素（MSTN）基因破坏促进肌肉生长、通过编辑钠/氢交换蛋白1（NHE1）基因获得病毒抗性，以及通过修饰性别决定基因控制雄性和雌性比例。此外，还探讨了在生物制药蛋白生产和动物生物多样性保护中的应用。尽管取得了进展，但仍存在一些局限性，包括同源定向修复效率低、脱靶效应、嵌合体以及种系传递的变异性。当前证据表明，种系验证和可扩展性严重缺乏，这为将这一潜力转化为商业化禽类生产（尤其是家禽育种）设置了障碍。还讨论了监管框架及其对食品和商业化的影响。未来研究应优先考虑精准编辑、可扩展的递送系统以及监管协调，以实现实践、伦理和负责任的实施。
**引言**
家禽生产是全球农业的重要组成部分，是发展中国家和发达国家负担得起的动物蛋白来源。鸡肉和鸡蛋对营养贡献显著，但传统育种在精确遗传改变、世代间隔、多基因复杂性和性别关联效率方面存在局限。这些限制激发了精准育种技术（尤其是基因组编辑）的兴趣。在细胞靶点中，原始生殖细胞（PGCs）因其可培养、编辑并重新导入以产生可遗传修饰而成为禽类基因组工程的理想选择。CRISPR/Cas系统因设计简便和可扩展性加速了禽类种系工程，已在鸡中实现针对经济性状（如MSTN敲除、NHE1编辑抗病毒、性别决定基因编辑）的靶向修饰。尽管进展迅速，但转化受限于不同遗传背景下的差异，以及同源定向修复（HDR）效率、脱靶效应、嵌合体和种系能力的变异性。本综述采用证据分层框架，从细胞级编辑、移植验证、种系传代到多代遗传，评估编辑平台、递送系统和报告应用，强调种系验证和转化障碍。
**禽类PGCs作为种系工程平台**
**发育与生物学特性**：禽类PGCs在胚胎早期发育阶段特化，通过胚胎血流迁移并定殖于发育中的性腺。不同禽类（如斑胸草雀）的PGCs发育存在物种特异性标记模式，鸡源标记系统可能无法直接转移。迁移途径使PGCs易于分离而不破坏胚胎发育，为禽类种系操作提供优势。近期研究表明，短期热应激（43°C）会下调多能性和种系标记物（如NANOG、POUV、DAZL、CVH、TERT）并降低定殖效率。**分离与培养**：PGCs可通过荧光激活细胞分选（FACS）或阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）抗体富集从血液或性腺组织中分离。体外培养需要含白血病抑制因子（LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和干细胞因子（SCF）的限定培养基。无饲养层培养系统可提高可重复性和可扩展性。补充0.5 mg ml
-1卵转铁蛋白可促进鸡PGCs增殖、粘附并减少氧化应激。培养系统在物种间不可完全转移，鸡、鸭、鹌鹑、鹅和斑胸草雀的PGCs培养条件依赖物种。长期培养可导致表观遗传漂变、自发分化和种系能力下降。**基因组编辑优势**：禽类PGCs因其可及性和种系潜能成为独特平台，允许体外遗传操作和导入前筛选编辑克隆，减少嵌合体，支持多重基因编辑，并可冷冻保存用于遗传资源保护。近期研究在地方鸡种中结合了PGCs衍生、冷冻库、种系嵌合再生和CRISPR/Cas9介导的TYRP1编辑，证明该平台可同时支持靶向遗传修饰和种质恢复。
**禽类PGCs中的基因组编辑技术与策略**
**编辑方法演化**：从低精度的病毒转基因和同源重组，到锌指核酸酶（ZFNs）和TALENs，再到CRISPR/Cas9，后者以RNA引导和更高可扩展性实现突破。Cas9介导的插入缺失（indel）效率通常超过50-80%，而精确敲入（HDR）仍低于5-10%。**CRISPR/Cas9机制与局限**：Cas9诱导双链断裂，通过非同源末端连接（NHEJ）或HDR修复。NHEJ用于基因敲除，HDR介导的敲入仍是主要瓶颈。多重编辑可同时靶向多个基因，但种系传递不一致限制其在家禽育种中的可靠性。**新兴技术**：碱基编辑可实现直接核苷酸转换而不产生双链断裂，但鸡PGCs中高水平的碱基切除修复降低了效率（MSTN位点35.7%，转铁蛋白位点55.5%）。先导编辑可进行靶向替换、插入和缺失，已在鸡成纤维细胞和PGCs中展示细胞级可行性，但缺乏种系传递证据。**体内编辑**：通过向新产蛋的胚盘或胚下腔注射腺病毒介导的CRISPR/Cas9，可直接编辑胚胎内源性PGCs，绕过分离、培养和移植。在鹌鹑、鸡和鸭中产生了嵌合体创始人，种系传递效率为2-11%，但嵌合体导致等位基因多样性，同时增加了育种复杂性。
**种系传递结果**
**证据分层与比较**：种系传递是禽类基因组编辑的主要阈值。表2显示，细胞级编辑与确认的生殖传递之间存在显著差距。优化培养和宿主系统（如白消安处理、MGSTII选择、无菌宿主）可提高供体来源后代比例（达94.68%），但可重复性仍需跨实验室和遗传背景验证。**影响因素**：供体-受体种系竞争、物种和品系特异性培养需求、培养导致的种系能力丧失以及内源性生殖细胞清除效率是关键因素。**综合展望**：CRISPR/Cas9在常规禽类种系编辑中最为成熟，但平台选择应基于编辑目标、所需精度和下游应用。
**禽类PGCs基因组编辑的递送策略**
**体外PGCs编辑**：传统方法涉及PGCs分离、培养、编辑、克隆筛选和移植，提供等位基因控制，但培养可能降低种系能力。**电穿孔与核转染**：在无饲养层和无血清条件下，电穿孔转染效率可达70%以上，但需优化以保持细胞活力和种系能力。**病毒递送**：慢病毒载体整合入基因组，存在插入突变风险；腺相关病毒（AAV）载体主要呈游离状态，但承载容量有限（约4.5 kb）；腺病毒载体呈游离状态，可承载大片段（8-30 kb），但表达短暂且免疫原性强。**核糖核蛋白（RNP）递送**：Cas9 RNP提供瞬时活性，避免基因组整合，但效率依赖方案。**修复模板**：单链DNA供体可提高HDR效率并降低细胞毒性，而双链DNA供体适用于大片段插入但效率低。**纳米颗粒系统**：非病毒递送潜力大，但禽类PGCs中验证有限。**精子转染辅助基因编辑（STAGE）**：利用精子递送试剂，绕过PGCs培养，但等位基因控制和嵌合体问题突出。**无菌宿主模型**：白消安处理、遗传无菌宿主（如DDX4敲除）和诱导型Caspase-9（iCaspase9）系统可减少内源性生殖细胞竞争，提高供体PGCs贡献。
**禽类PGCs中的基因组编辑应用**
**生产性状与生长增强**：CRISPR/Cas9介导的MSTN破坏增加骨骼肌质量，减少脂肪沉积。OVA基因编辑可生产低过敏性鸡蛋，但可能引入代谢和结构福利风险。**疾病抗性**：NHE1受体编辑（色氨酸-38缺失）赋予对禽白血病病毒J亚群（ALV-J）的抗性；ANP32A基因编辑（N129I-D130N）使鸡不传播H9N2禽流感病毒，但高剂量攻毒显示病毒逃逸，需多基因靶向。**行为与生理性状**：候选基因包括应激轴（CRH、CRHR1、NR3C1）、血清素能/多巴胺能通路（SLC6A4、TPH2、DRD4）和昼夜节律调节因子（CLOCK、BMAL1、PER2），但多为概念性，缺乏种系传递和育种验证。**保护与遗传资源管理**：PGCs冷冻库和种系嵌合再生技术已用于地方鸡种TYRP1编辑，支持品种恢复和等位基因回收，但生态基因组编辑仍属概念阶段。
**禽类PGCs的性别决定与繁殖优化**
**分子基础**：禽类为ZW性别决定系统，雄鸟ZZ，雌鸟ZW。DMRT1对睾丸发育至关重要，FOXL2和CYP19A1支持卵巢发育。**生产意义**：雄性雏鸡淘汰是严重福利和伦理问题。基因组编辑可通过靶向DMRT1、FOXL2或SLC45A2基因实现性别控制。SLC45A2敲除导致眼睛色素性别依赖性表型，可实现卵内性别鉴定。**转化局限**：完全性别逆转在生物学上受限，且缺乏商业孵化场验证。基于报告基因的早期性别鉴定比直接编辑性别通路更接近近期应用。
**局限、生物安全与监管挑战**
**技术与生物学局限**：精确DNA修复效率低、嵌合体、种系传递变异和长期培养导致种系能力丧失。**生物安全与环境**：脱靶效应、基因毒性（CRISPR/Cas9诱导DNA损伤和凋亡）以及释放编辑鸟类对生态的影响需评估。**全球监管框架**：美国采用风险导向的FDA指南；欧盟将基因编辑动物归为GMO监管；日本采用产品导向的通知制度；中国缺乏动物特异性框架；阿根廷和巴西采用产品导向的个案评估。监管碎片化是商业化主要障碍。**伦理与社会约束**：生产导向编辑可能增加代谢应激，性别控制涉及伦理问题，消费者接受度因性状和感知效益而异。
**未来研究重点与工业转化路线图**
**超越双链断裂的精准编辑**：碱基编辑和先导编辑需在禽类种系背景下验证。**改进精确敲入**：优化供体模板、修复通路调控和细胞周期同步。**标准化PGCs培养与评估**：开发无饲养层、品系特异性培养基，并报告培养持续时间、核型、种系标记物保留、迁移能力和种系传递等指标。**开发转化相容的递送系统**：RNP递送和纳米颗粒平台可提高生物安全性。**整合福利、育种与治理**：多代研究评估稳定性和表型效应，生态监测和透明沟通对公众接受至关重要。
**禽类PGCs基因组编辑的转化概念框架**
转化成功取决于编辑精度、递送效率、种系能力、受体准备、种系传递、动物福利、可扩展性和监管配合的同步优化。提出一个系统级框架，将PGCs生物学、编辑工具和递送系统作为核心基础，通过三个核心决定因素（编辑精度、递送效率、种系能力）相互作用，最终过滤出下游应用（生长、疾病抗性、性别决定、保护）。
**拟议的实验基准模型**
现有文献缺乏标准化比较。未来应采用对照基准设计，在相同条件下评估多个编辑系统，测量编辑效率、脱靶频率、细胞活力、种系传递率、克隆纯度、种系标记物保留、性腺定殖、多代遗传和表型稳定性、福利及可扩展性指标。建立这样的评估体系将促进客观比较和加速优化。
**结论**
本综述的核心价值在于，禽类PGCs基因组编辑不应仅通过培养细胞中的编辑成功来评估，而应根据有意义的家禽应用所需的验证深度。目前，PGCs是最有效的可遗传编辑平台，尤其在鸡中，但商业级实施仍受限于种系能力保持、一致传递、可扩展工作流程和监管可接受性。未来研究应使用可量化基准（如供体细胞贡献、种系传递率、多代遗传、跨实验室可重复性、可扩展性、福利和监管终点）对转化就绪度进行分类，以推动技术从实验平台向实际育种技术转变。
