SIRT7介导的FOXO4去琥珀酰化抑制铁死亡以减轻LPS诱导的急性肺损伤

《Redox Biology》：SIRT7-Mediated Desuccinylation of FOXO4 Suppresses Ferroptosis to Alleviate LPS-Induced Acute Lung Injury

　　

蛋白质琥珀酰化（succinylation）是一种新兴的翻译后修饰（post-translational modification, PTM），在炎症性疾病的发生和发展中起着关键作用。由致死性脂质过氧化（lipid peroxidation）驱动的铁死亡（ferroptosis）与炎症的发病机制密切相关。靶向铁死亡近来已成为急性肺损伤（acute lung injury, ALI）的一种有前景的治疗方法。然而，蛋白质琥珀酰化与铁死亡在调控ALI中的相互作用仍不明确。FOXO4是氧化应激反应的关键调控因子，受到多种翻译后修饰的动态调控。研究人员鉴定出SIRT7是FOXO4激活和核定位所必需的去琥珀酰化酶（desuccinylase）。机制上，SIRT7在赖氨酸139（lysine 139, K139）位点对FOXO4进行去琥珀酰化，从而抑制MDM2介导的K48连接的多聚泛素化（K48-linked polyubiquitination），这稳定了FOXO4并维持其核滞留，进而上调谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）的表达，并抑制脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells, AECs）铁死亡。体内实验表明，SIRT7敲除（SIRT7-knockout, SIRT7-KO）加剧了LPS诱导的ALI。此外，通过腺相关病毒6（adeno-associated virus 6, AAV6）递送模拟去琥珀酰化的FOXO4-K139R突变体，显著减轻了SIRT7-KO小鼠的肺铁死亡和组织病理学损伤。值得注意的是，利用三叶苷（trilobatin, TLB）对SIRT7进行药理学激活，显著减轻了LPS攻击小鼠的ALI，确立了该病理过程的潜在治疗途径。综上，这些发现描绘了一个先前未被认识的机制，即SIRT7通过去琥珀酰化调控FOXO4的核滞留和激活，将SIRT7-FOXO4轴确立为ALI干预的潜在治疗靶点和理论基础。

**研究背景与研究问题：**
急性肺损伤（ALI）及其严重形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是由感染、创伤等多种因素导致的弥漫性炎症性肺部疾病，临床管理困难，死亡率高达约40%。肺泡上皮细胞（AECs）损伤是ALI发病的关键事件，而铁死亡（ferroptosis）——一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡——在AECs中异常激活，被认为是ALI的重要病理机制。蛋白质琥珀酰化（succinylation）是一种新兴的翻译后修饰（PTM），在炎症性疾病中发挥重要调控作用，但琥珀酰化与铁死亡在ALI调控中的相互作用尚不清楚。FOXO4是氧化应激反应的关键转录因子，其活性受多种PTM动态调控，但琥珀酰化对FOXO4的调控及其在ALI中的作用尚未被探索。SIRT7作为NAD⁺依赖的去乙酰化酶，近期被证实具有去琥珀酰化酶活性，但其在ALI中的具体机制有待阐明。本研究旨在揭示SIRT7是否通过调控FOXO4琥珀酰化影响铁死亡，从而参与ALI发病机制。

**研究结论与意义：**
研究人员发现，SIRT7通过去琥珀酰化FOXO4（K139位点）抑制其MDM2介导的K48连接多聚泛素化，稳定FOXO4并促进其核滞留，进而上调GPX4转录，抑制脂多糖（LPS）诱导的AECs铁死亡，减轻ALI。体内实验证实，SIRT7敲除加剧ALI，而递送模拟去琥珀酰化的FOXO4-K139R突变体可显著减轻病理损伤。SIRT7激动剂三叶苷（TLB）通过激活SIRT7酶活性和上调其表达，有效缓解LPS诱导的ALI。临床样本中ARDS患者肺泡灌洗液（BALF）的SIRT7 mRNA水平显著降低，与疾病严重程度呈负相关。该研究首次定义了SIRT7-FOXO4轴作为ALI铁死亡的关键调控通路，为ALI治疗提供了新靶点。论文发表在《Redox Biology》。

**主要关键技术方法：**
1. **免疫沉淀-质谱（IP-MS）**：鉴定SIRT7的相互作用蛋白，发现FOXO4为高可信度结合伙伴。
2. **CRISPR/Cas9基因编辑**：构建SIRT7全身敲除（SIRT7-KO）小鼠及MLE-12细胞稳定敲除系。
3. **染色质免疫沉淀（ChIP）及双荧光素酶报告基因实验**：验证FOXO4直接结合GPX4启动子并调控其转录。
4. **分子对接（Molecular docking）**：预测SIRT7与FOXO4结合及TLB与SIRT7结合模式。
5. **体外去琥珀酰酶活性检测**：使用荧光底物H3K122suc-AMC肽段评估TLB对SIRT7酶活性的直接激活效应。
6. **透射电子显微镜（TEM）**：评估线粒体超微结构以量化铁死亡阳性细胞。
7. **样本队列来源**：纳入45例ARDS患者及20例健康对照的肺泡灌洗液（BALF），来自南京大学医学院附属金陵医院。

**研究结果：**
**SIRT7介导ALI中蛋白质泛琥珀酰化**：LPS诱导的ALI小鼠肺组织及MLE-12细胞中泛琥珀酰化水平显著升高，SIRT7 mRNA和蛋白表达下调。SIRT7敲除进一步升高泛琥珀酰化，而SIRT7过表达抑制之。
**SIRT7缺失加重LPS诱导的ALI**：SIRT7-KO小鼠在LPS攻击后肺组织病理损伤、肺泡灌洗液（BALF）炎症因子、肺水肿及死亡率均显著加重，且中性粒细胞浸润增加。
**SIRT7与FOXO4相互作用**：IP-MS鉴定FOXO4为SIRT7结合蛋白，分子对接显示热力学稳定结合。内源性及外源性免疫共沉淀（Co-IP）证实二者直接相互作用，免疫荧光显示SIRT7与FOXO4共定位于细胞核，LPS处理促进FOXO4胞质转位。
**SIRT7去琥珀酰化FOXO4（K139）抑制其MDM2介导的K48连接泛素化降解**：GPSuc预测及突变验证确定K139为FOXO4主要琥珀酰化位点。SIRT7特异性地去琥珀酰化FOXO4（不影响乙酰化、乳酰化、巴豆酰化）。SIRT7敲除缩短FOXO4半衰期，过表达延长之；K139R突变稳定FOXO4，K139E促进降解。SIRT7敲除增强FOXO4泛素化，过表达抑制之，且该泛素化为K48连接依赖。MDM2鉴定为E3泛素连接酶，K139E增强MDM2-FOXO4结合及泛素化，K139R抑制之。
**SIRT7缺失加重体内LPS诱导的铁死亡**：RNA-seq显示SIRT7-KO小鼠肺组织差异基因富集于铁死亡及谷胱甘肽代谢通路，GPX4等下调。Western blot证实铁死亡蛋白标志物改变，TEM显示线粒体萎缩、嵴消失等典型铁死亡形态，生化指标（Fe²⁺、4-HNE、MDA、ROS）升高，SOD、GSH降低。
**SIRT7在体外负调控LPS诱导的铁死亡**：SIRT7敲除加剧MLE-12细胞铁死亡表型，过表达则抑制之。铁死亡抑制剂Fer-1可逆转SIRT7敲除诱导的细胞毒性，而凋亡或NLRP3抑制剂无效。
**铁死亡抑制剂减轻而诱导剂加重LPS诱导的ALI及炎症**：在SIRT7-KO小鼠中，Fer-1预处理减轻肺损伤、炎症和水肿，RSL3加重之。体外实验类似。
**SIRT7通过调节FOXO4-GPX4信号轴抑制铁死亡**：ChIP-qPCR及双荧光素酶报告实验证实FOXO4直接结合GPX4启动子。FOXO4过表达上调GPX4，敲低下调之。SIRT7敲除后GPX4下降，FOXO4过表达可恢复，且K139R恢复效果优于WT。
**FOXO4（K139）去琥珀酰化保护SIRT7-KO小鼠免受LPS诱导的ALI**：AAV6递送FOXO4-K139R显著减轻SIRT7-KO小鼠肺损伤、炎症、铁死亡相关指标及线粒体超微结构病理，效果优于FOXO4-WT和K139E。
**SIRT7激动剂缓解LPS诱导的ALI**：三叶苷（TLB）与SIRT7分子对接结合能强，体内给药上调SIRT7表达并降低FOXO4琥珀酰化水平，减轻肺损伤和炎症。体外实验显示TLB直接激活SIRT7去琥珀酰酶活性（EC₅₀ = 3.018 μM）。临床样本中ARDS患者BALF的SIRT7 mRNA水平显著降低，与APACHE II评分、CRP、NLR、PCT呈负相关。

**讨论与结论：**
讨论部分总结：本研究首次揭示SIRT7通过去琥珀酰化FOXO4（K139）抑制MDM2介导的K48连接泛素化，稳定FOXO4并促进其核滞留，上调GPX4表达，抑制AECs铁死亡，从而减轻ALI。SIRT7-FOXO4轴为ALI提供了潜在治疗靶点。研究同时指出，TLB通过双重机制（转录上调及直接酶激活）发挥保护作用。临床数据支持SIRT7在ARDS中的保护性抗炎功能。研究局限性包括：全身性SIRT7-KO模型无法精确归因于AECs；缺乏人类肺组织直接验证；缺乏K139位点特异性抗体。未来需利用条件性KO模型、单细胞分析及更多临床样本验证。
结论部分翻译：综上所述，本研究表明SIRT7介导的FOXO4去琥珀酰化减轻了LPS诱导的ALI。这些发现揭示了ALI发病机制中一个先前未被认识的SIRT7-FOXO4轴，并为开发针对ALI的靶向治疗策略奠定了机制基础。