《Redox Biology》：BMAL1 Deficiency Exacerbates HDM-Induced Asthma by Promoting JUN-Mediated Lipid Peroxidation and Airway Epithelial Ferroptosis
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哮喘表现出显著的昼夜节律变化（circadian variation），然而将时钟紊乱与气道上皮损伤联系起来的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员确定了核心时钟组件BMAL1（Brain and muscle ARNT-like protein-1）是一个关
哮喘表现出显著的昼夜节律变化（circadian variation），然而将时钟紊乱与气道上皮损伤联系起来的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员确定了核心时钟组件BMAL1（Brain and muscle ARNT-like protein-1）是一个关键的上皮调节因子，它在过敏性气道炎症期间抑制铁死亡（ferroptosis）相关的损伤。利用屋尘螨（house dust mite, HDM）诱导的小鼠哮喘模型和HDM刺激的人支气管上皮细胞，研究人员发现BMAL1表达显著降低，而BMAL1缺失明显加重了气道炎症、黏液化生和重塑。整合的转录组学和代谢组学分析揭示了与铁死亡相关的炎症激活和代谢重编程的特征。一致地，BMAL1缺失在体内和体外均增加了脂质过氧化（lipid peroxidation）和反应性氧物种（reactive oxygen species, ROS）水平，下调了GPX4（Glutathione Peroxidase 4）和xCT（SLC7A11）的表达，并上调了COX2（Cyclooxygenase 2）在气道上皮中的表达。Ferrostatin-1治疗减轻了这些改变，并部分挽救了Bmal1缺陷小鼠中加重的哮喘表型。值得注意的是，BMAL1的组成性过表达也恶化了HDM诱导的气道病理，提示BMAL1节律性振荡的破坏促进了疾病进展。机制上，BMAL1缺失激活了AP-1（Activator Protein 1）通路，诱导了COX2表达，并促进了铁死亡相关的上皮损伤，而JUN的抑制缓解了这一表型。此外，褪黑素（melatonin）也减轻了与BMAL1缺失相关的加重气道病理和铁死亡相关变化。总之，这些发现将BMAL1确定为气道上皮铁死亡的关键调节因子，并强调了JUN信号通路以及COX2相关的前列腺素（prostaglandin）反应作为昼夜节律失调驱动的哮喘加重下游组件。
**论文解读：BMAL1缺失通过JUN/COX2轴促进气道上皮铁死亡加重HDM诱导的哮喘**
**研究背景与问题**
哮喘是一种以昼夜节律变化为特征的慢性气道疾病，其症状和急性加重常在夜间恶化。然而，时钟分子机制如何与气道上皮损伤相联系尚不明确。核心时钟组件BMAL1（Brain and muscle ARNT-like protein-1）在维持气道稳态中发挥关键作用，其缺失可加重气道炎症和重塑。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖的调节性细胞死亡，由脂质过氧化驱动，在哮喘的气道上皮损伤中逐渐被认识。尽管BMAL1调节抗氧化防御和谷胱甘肽代谢，但其在过敏性气道炎症中是否调控铁死亡仍不清楚。因此，本研究旨在探索BMAL1是否通过调节铁死亡参与HDM（屋尘螨）诱导的哮喘病理，并阐明其下游分子机制。
**研究内容与结论**
研究人员利用HDM诱导的小鼠哮喘模型和HDM刺激的人支气管上皮细胞（HBE135-E6E7细胞系，来源ATCC），结合转录组学、代谢组学、遗传学（Bmal1敲除小鼠，Bmal1
-/-，来源View Solid Biotech）和药理学方法，发现BMAL1缺失显著加重气道炎症、黏液化生和重塑，同时伴随脂质过氧化增强、抗氧化防御（GPX4和xCT）下降及COX2上调。Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）部分逆转了这些改变，证明铁死亡参与其中。值得注意的是，BMAL1组成性过表达未能保护反而加重病理，提示BMAL1节律性振荡而非绝对表达量至关重要。机制上，BMAL1缺失激活AP-1通路，选择性上调JUN蛋白，增强JUN与PTGS2（COX2基因）启动子结合，导致COX2表达和前列腺素E2（PGE2）增加。JUN抑制剂SP600125减轻了铁死亡相关上皮损伤和气道炎症。褪黑素（一种昼夜节律输出激素）在Bmal1缺陷小鼠中同样抑制JUN信号并缓解病理。结论：BMAL1是气道上皮铁死亡的关键调节因子，JUN/COX2轴是其下游效应通路，维持昼夜节律-氧化还原稳态对气道保护至关重要，靶向铁死亡相关上皮损伤是过敏性气道疾病的潜在治疗策略。该论文发表在《Redox Biology》。
**主要技术方法**
研究采用HDM诱导的小鼠哮喘模型（C57BL/6J野生型小鼠，来源南方医科大学动物中心；Bmal1杂合小鼠繁育为敲除鼠）和HDM刺激的人支气管上皮细胞系HBE135-E6E7（ATCC）。关键技术包括：转录组测序（RNA-seq）和液相色谱-质谱（LC-MS）非靶向代谢组学分析（肺组织）；免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）和Western blot检测蛋白表达；BODIPY 581/591 C11荧光探针及MDA（丙二醛）试剂盒检测脂质过氧化；DCFH-DA探针检测ROS；Cut&Tag-qPCR评估JUN与PTGS2启动子结合；AAV6（腺相关病毒血清型6）介导的气道BMAL1过表达；药理学干预包括Ferrostatin-1、SP600125（JUN抑制剂）和褪黑素腹腔注射。
**研究结果**
1. **BMAL1 deficiency exacerbates HDM-induced airway inflammation**：通过免疫组化发现HDM处理后气道上皮BMAL1表达降低；Bmal1敲除小鼠（Bmal1-ko）在HDM挑战后，气道炎症浸润、黏液分泌和胶原沉积（H&E、PAS、Masson三色染色）显著加重，支气管肺泡灌洗液（BALF）中总炎症细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞增多，Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）和上皮警报素（IL-25、IL-33）升高，血清HDM特异性IgE增加。
2. **BMAL1 deficiency is associated with inflammatory activation and ferroptosis-related metabolic reprogramming**：转录组分析显示Bmal1-ko+HDM肺组织中1434个基因上调、916个下调，GO和KEGG富集分析揭示炎症和铁死亡相关通路激活；代谢组学分析显示脂质过氧化、不饱和脂肪酸代谢和谷胱甘肽代谢相关代谢物改变，氧化脂质增加，还原性代谢物减少。
3. **BMAL1 deficiency enhances ferroptosis-associated epithelial injury in vivo**：体内免疫组化和Western blot显示Bmal1-ko小鼠气道上皮中GPX4和xCT蛋白降低，COX2和4-HNE（4-羟基壬烯醛，脂质过氧化标志物）升高，MDA水平升高。Ferrostatin-1处理减轻了这些分子变化和气道病理。
4. **BMAL1 deficiency promotes ferroptosis in HDM-stimulated airway epithelial cells**：体外BMAL1敲低（siRNA）的HBE细胞在HDM刺激下，细胞活力下降，MDA和BODIPY荧光增强，ROS升高，GPX4和xCT降低，COX2升高；Ferrostatin-1部分逆转这些变化。
5. **BMAL1 overexpression aggravates HDM-induced airway inflammation in vivo**：AAV6-BMAL1气道滴注导致BMAL1过表达，但未保护反而加重HDM诱导的气道炎症、黏液化和重塑，说明节律稳态而非单纯表达量重要。
6. **Melatonin attenuates HDM-induced airway pathology and ferroptosis-associated epithelial injury**：褪黑素（10 mg/kg）在野生型小鼠中降低血清褪黑素水平（HDM后减少），改善气道病理和铁死亡标志物；在Bmal1-ko小鼠中同样减轻炎症和铁死亡相关变化。
7. **BMAL1 deficiency licenses JUN-dependent COX2 activation**：RNA-seq显示BMAL1敲低后AP-1通路激活，JUN蛋白选择性升高（c-FOS不变）；免疫荧光证实Bmal1-ko小鼠气道上皮JUN积累；代谢组学发现前列腺素G2（PGG2）增加，ELISA确认PGE2升高；Cut&Tag-qPCR显示JUN在PTGS2启动子结合增强。
8. **JUN inhibition attenuates ferroptosis-associated epithelial injury under BMAL1-deficient conditions**：JUN抑制剂SP600125（30 mg/kg）在Bmal1-ko小鼠中减轻气道炎症、胶原沉积和铁死亡标志物（4-HNE、COX2降低，GPX4恢复）；体外SP600125降低BMAL1缺陷HBE细胞中脂质过氧化和ROS，恢复GPX4和xCT，降低COX2和JUN。
**讨论与结论**
讨论部分指出，BMAL1缺失通过干扰昼夜节律-氧化还原稳态，增强了气道上皮对铁死亡的易感性，而JUN/COX2轴是关键的分子连接。BMAL1的双向效应（缺失和过表达均有害）强调了节律精度的必要性。褪黑素的保护作用可能通过恢复昼夜节律和抑制氧化应激实现，而不依赖于增加BMAL1表达。研究存在局限性：未直接测量铁积累或活性铁水平；COX2特异性抑制未进行；使用全局Bmal1敲除小鼠而非上皮特异性模型；体外仅用永生化细胞系。未来需结合细胞特异性模型、时间分辨方法和原代细胞进一步验证。
**研究结论翻译**：总之，研究人员确定BMAL1是过敏性哮喘中气道上皮铁死亡的关键调节因子。BMAL1缺失促进HDM诱导的气道炎症和重塑，伴随脂质过氧化增加、抗氧化防御受损、JUN信号激活和COX2相关的前列腺素反应。铁死亡抑制、JUN抑制和褪黑素能够减轻这种加重表型，进一步支持了昼夜节律紊乱与上皮氧化还原损伤之间的功能联系。结合BMAL1组成性过表达无益的观察，这些发现表明维持昼夜节律-氧化还原稳态对气道保护至关重要，并为靶向过敏性气道疾病中的铁死亡相关上皮损伤提供了理论依据。
