黄瓜2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（Cs2OGD）超家族的全基因组鉴定及CsF3H2在盐胁迫响应中的功能分析

《Scientia Horticulturae》：Genome-wide identification of the cucumber 2-OXOGLUTARATE-DEPENDENT DIOXYGENASE (Cs2OGD) superfamily and functional analysis of CsF3H2 in salt stress response

　　

土壤盐渍化威胁可持续农业。黄瓜（Cucumis sativus L.）作为全球重要蔬菜，对盐胁迫高度敏感。2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（2-OGD）超家族是植物中第二大超家族，在生长发育和胁迫耐受中发挥关键作用。然而，其在黄瓜中的功能仍大多未知。本研究中，研究人员在黄瓜基因组中鉴定出89个Cs2OGD基因，将其归入3个亚家族和28个分支。共线性分析揭示，片段重复是家族扩张的主要驱动力，且在甜瓜（Cucumis melo）中观察到最高的同源性和保守的赤霉素代谢。启动子分析发现2,686个顺式作用元件，其中53%与胁迫响应相关。转录因子（TF）结合分析表明，CsDofs是主要的TF调控因子，靶向该家族85%的成员。RNA-seq分析揭示Cs2OGD基因在黄瓜组织中呈现5种不同的表达模式（Group I–V）。进一步研究组成型高表达基因（Group I和II）在非生物胁迫（热、冷、盐、干旱）和激素处理（SA、ABA、GA、MeJA）下的表达，描绘了其响应谱，并鉴定CsF3H2为调控耐盐性的关键成员。亚细胞定位证实CsF3H2位于细胞核和内质网。过表达CsF3H2显著增强了黄酮/花青素含量，提高了抗氧化酶（SOD、CAT、APX）活性，并上调了抗氧化酶（CsCSD、CsFSD、CsMSD、CsCAT）和离子稳态基因（CsSOS1、CsNHX、CsHKT）的表达，从而提高了耐盐性。综上，本研究提供了Cs2OGD超家族的综合进化与功能分析，并鉴定了一个有价值的遗传资源以改善作物抗逆性。

**研究背景与问题**
土壤盐渍化严重威胁全球可持续农业，造成年均超过270亿美元的经济损失。黄瓜（Cucumis sativus L.）作为全球重要的经济蔬菜（2022年种植面积210万公顷，产量9470万吨），对盐胁迫高度敏感，50-70 mM NaCl即可导致不可逆损伤。2-酮戊二酸依赖性双加氧酶（2-OGD）超家族是植物中仅次于细胞色素P450的第二大酶超家族，通过催化羟基化、去甲基化等氧化反应，广泛参与赤霉素、黄酮类、乙烯、茉莉酸等代谢途径，在植物生长发育和逆境适应中起关键作用。然而，该家族在黄瓜中的功能尚未系统解析，尤其F3H（黄烷酮3-羟化酶）在盐胁迫响应中的作用尚不清楚。因此，研究人员开展全基因组鉴定与功能分析，旨在揭示Cs2OGD超家族进化特征，并挖掘耐盐关键基因CsF3H2。
**主要研究内容与结论**
研究人员利用隐马尔可夫模型（HMM）和BLASTp在黄瓜基因组中鉴定出89个Cs2OGD基因，并将其分为DOXA、DOXB、DOXC三个亚家族（28个分支）。进化分析表明，片段重复是家族扩张的主要驱动力，Ka/Ks<1提示纯化选择主导；与甜瓜（Cucumis melo）的共线性最强，且赤霉素代谢途径高度保守。启动子分析发现2686个顺式作用元件，53%与胁迫响应相关；转录因子结合预测显示CsDofs靶向85%的家族成员。RNA-seq分析将89个基因分为5种表达模式（Group I–V），其中Group I和II为组成型高表达基因。进一步通过qRT-PCR分析23个候选基因在冷、热、盐、干旱胁迫及SA、ABA、GA、MeJA处理下的表达，发现CsF3H2在多种胁迫和激素处理下均显著上调，尤其在盐胁迫下83.04倍诱导。亚细胞定位证实CsF3H2定位于细胞核和内质网。通过发根农杆菌K599介导的转化获得CsF3H2过表达黄瓜毛根，在100 mM NaCl处理24小时后，过表达植株根系中黄酮和花青素含量显著增加，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性升高，丙二醛（MDA）、H₂O₂含量和相对电导率降低，同时抗氧化酶基因（CsCSD、CsFSD、CsMSD、CsCAT）和离子稳态基因（CsSOS1、CsNHX、CsHKT）表达上调。该研究为黄瓜耐盐育种提供了重要基因资源，论文发表在《Scientia Horticulturae》。
**关键技术方法**
全基因组鉴定使用HMM（Pfam PF03171）和BLASTp（拟南芥At2OGD序列）；系统发育分析采用MEGA 12.0邻接法（1000次自展）；共线性分析用MCScan-X；启动子顺式元件用PlantCARE；转录因子结合预测用PlantRegMap（p<1×10^-5）；RNA-seq数据来自NCBI PRJNA80169（包括10个组织）；qRT-PCR使用SYBR Green法；亚细胞定位通过35S::CsF3H2-eGFP在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片瞬时表达（共定位ER和NLS标记）；过表达采用发根农杆菌K599介导的黄瓜毛根转化；生理指标使用商业试剂盒（Comin Biotechnology）。
**研究结果**
3.1 Cs2OGD超家族的全基因组鉴定、理化性质及亚细胞定位预测：通过HMM和BLASTp鉴定出89个Cs2OGD基因，CDS长度366-2622 bp，编码121-873个氨基酸，多数为不稳定亲水蛋白，pI 4.82-9.38，亚细胞定位预测以细胞质为主。
3.2 Cs2OGD超家族的染色体分布：基因在3号染色体最多（21个），5号最少（7个），呈现非随机分布。
3.3 Cs2OGD超家族的系统发育分析：邻接法构建系统发育树，分为DOXA（5个基因，1个分支）、DOXB（9个基因，4个分支）、DOXC（75个基因，23个分支）三个亚家族，DOXC亚家族参与赤霉素、黄酮、乙烯、香豆素等多种代谢途径，与拟南芥有7个直系同源对。
3.4 Cs2OGD超家族保守基序、结构域、基因结构及蛋白三维结构分析：所有成员含HxD/E…H基序（结合Fe²⁺），10个成员缺失RxS/T基序（可能影响底物结合）。DOXB含P4Hc结构域，DOXC含DIOX_N结构域。基因结构显示亚家族内保守的外显子-内含子组织。
3.5 Cs2OGD超家族的共线性分析：种内共线性鉴定8个基因对（87.5%为片段重复，Ka/Ks<1），种间共线性分析发现黄瓜与甜瓜共线性最强（76对），其中赤霉素代谢分支占33.90%。
3.6 Cs2OGD基因启动子顺式作用元件分析：共2686个元件，53%为胁迫响应元件（MYB、MYC、ARE为主），29%为激素响应元件（ABRE、ERE、TCA-element），19%为生长发育元件（G-box、TCT-motif、AE-box）。
3.7 Cs2OGD超家族的转录因子调控网络：预测37个结合转录因子，CsDofs靶向最多（76个基因），CsF3H2被14个转录因子靶向。
3.8 Cs2OGD基因在不同组织中的表达模式：RNA-seq将89个基因分为5类，Group I和II为组成型高表达，Group V在根和卷须中特异高表达。
3.9 Cs2OGD超家族对非生物胁迫的响应：23个Gene I和II基因在冷、热、盐、干旱胁迫下均显著上调，CsF3H2在盐胁迫下上调83.04倍，CsACO3、CsF6′H2等也对多种胁迫响应。
3.10 Cs2OGD超家族对激素信号的响应：ABA和MeJA强烈诱导所有基因表达，GA诱导部分基因，SA诱导瞬时表达，CsF3H2对所有激素响应显著（MeJA诱导122.89倍）。
3.11 CsF3H2在盐胁迫响应中的功能分析：亚细胞定位确认CsF3H2位于细胞核和内质网。过表达CsF3H2显著提高黄酮和花青素含量，降低H₂O₂、MDA和电导率，提高SOD、CAT、APX活性。
3.12 CsF3H2正调控抗氧化和离子稳态基因表达：过表达CsF3H2上调抗氧化酶基因（CsCSD、CsFSD、CsMSD、CsCAT）和离子稳态基因（CsSOS1、CsNHX、CsHKT）表达。
**讨论与结论**
讨论部分总结了Cs2OGD超家族的进化与功能特征：DOXA和DOXB亚家族基因数量少、功能保守（DNA修复、细胞壁修饰），DOXC亚家族最大且功能多样，参与赤霉素、黄酮、乙烯、香豆素、茉莉酸等代谢途径。缺失RxS/T基序的成员可能催化活性降低。片段重复是家族扩张主因，赤霉素代谢途径在进化中高度保守。转录因子Dof靶向多数成员，CsF3H2被多个转录因子调控，可能参与ROS和激素信号通路。CsF3H2定位于细胞核和内质网，通过提高黄酮/花青素含量增强抗氧化能力，并协同调控抗氧化和离子稳态途径缓解盐胁迫。毛根系统为快速筛选平台，但全株稳定转化仍需进一步验证。
结论：研究人员在黄瓜基因组中鉴定出89个Cs2OGD基因，分为3个亚家族28个分支。进化分析表明片段重复是家族扩张的主要驱动力，与甜瓜共线性最强且赤霉素代谢保守。调控分析显示启动子中53%为胁迫响应元件，CsDofs靶向85%成员。表达谱显示5种模式，通过筛选组成型高表达基因在非生物胁迫和激素处理下的表达，鉴定CsF3H2为耐盐关键调控因子。功能验证确认CsF3H2定位于细胞核和内质网，其过表达通过增加黄酮和花青素含量、提高抗氧化酶活性及转录水平、上调离子稳态基因，从而增强耐盐性。本研究为改良作物抗逆性提供了Cs2OGD超家族的综合分析及有价值的遗传资源（CsF3H2）。