综述：用于即时检测的环介导等温扩增：原理、应用和技术整合策略

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Loop-mediated isothermal amplification for point-of-care testing: Principles, applications, and technological integration strategies

　　

环介导等温扩增（LAMP）作为一种高效且简单的核酸扩增技术，近年来在即时检测（POCT）领域获得了广泛关注并经历了快速发展。凭借其独特的引物设计和等温扩增机制，LAMP能够在无需复杂仪器的情况下快速、特异地检测目标核酸，从而满足对快速、便捷POCT的需求。研究人员普遍认为它是用于POCT的最有前景的核酸测试方法之一。此外，LAMP与CRISPR-Cas系统、可编程核酸酶和微流控平台等前沿技术的整合，为提升检测灵敏度、实现多重分析以及开发完全集成的“样本进-结果出”工作流程提供了创新策略，并在传染病诊断、癌症分子检测、食品安全监测和农业检疫中发挥着日益重要的作用。然而，LAMP目前面临关键瓶颈，包括多引物系统导致的非特异性扩增风险、复杂样本基质中反应稳定性不足，以及构建封闭集成系统时的工程挑战。本综述批判性地审视了现有研究，阐述了LAMP的核心原理、其与互补方法的整合，以及基于LAMP的POCT应用的现状。最终目标是提供一个系统性的参考框架，以促进LAMP从实验室技术向大规模POCT工具的转化。

1. 引言
在全球公共卫生事件增多、人口流动性增加和医疗资源分布不均的背景下，即时检测（POCT）已成为现代诊断系统的重要组成部分。POCT强调在患者附近快速获得结果，具有经济性、灵敏度、特异性、用户友好性、稳健性、无需设备操作和及时可交付性等特点，符合世界卫生组织制定的ASSURED标准。基于聚合酶链反应（PCR）的传统核酸检测方法需要高精度热循环仪和专业人员，限制了其在POCT中的部署。环介导等温扩增（LAMP）凭借其独特的多引物设计和链置换扩增机制，作为最有前景的POCT候选方法之一，引起了广泛关注。LAMP具有高效率、操作简便、强特异性和不依赖复杂仪器等优点。尽管展现出潜力，LAMP尚未实现大规模POCT部署，现有商业平台仍受限于高成本、专利依赖、有限的多重能力和对复杂样本适应性差等问题。因此，当前LAMP研究的目标不是复制商业产品，而是开发经济实惠、适应性强且稳健的系统，以便在实际应用中发挥作用。近年来，针对这些技术瓶颈的研究已从优化单个反应逐步转向在系统层面促进多技术协同创新。LAMP与CRISPR-Cas和PfAgo等高特异性核酸识别系统的整合显著提升了检测特异性；微流控的引入为开发封闭、集成和多重检测提供了工程基础；冻干试剂、一锅反应和智能手机辅助读数等策略显著提高了LAMP在实际应用中的可及性和一致性。本综述系统性地概述了LAMP在POCT领域中的基本原理、检测方法、多技术整合策略以及在不同应用场景中的研究进展，旨在为LAMP在精准医学和公共卫生中的发展提供参考框架。

2. 环介导等温扩增技术概述
2.1. LAMP的技术原理及与其他扩增方法的比较分析
环介导等温扩增（LAMP）是Notomi等人于2000年开发的一种核酸扩增技术。该方法依赖于具有高链置换活性的Bst DNA聚合酶和一组特异性设计的引物。Bst DNA聚合酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bst）天然DNA聚合酶的大片段，保留了天然酶的热稳定性和链置换活性，以及5'→3' DNA聚合酶活性，但缺乏5'→3'外切核酸酶活性。LAMP反应通常使用两对引物：内引物包括正向内引物（FIP）和反向内引物（BIP），外引物包括F3和B3。FIP包含F1c和F2序列，BIP包含B1c和B2序列，这些引物共同识别靶基因上的六个不同区域，确保了反应的高特异性。LAMP反应分为两个阶段：起始阶段和循环扩增阶段。在高温条件下（通常65℃），DNA双螺旋变得不稳定，FIP中的F2序列与模板的F2c区域结合，启动Bst DNA聚合酶的链置换合成。随后外引物F3与F3c区域结合并延伸，置换出FIP生成的链。被置换的链在其5'端含有互补的F1c序列，3'端含有F1序列，自退火形成茎环结构。以此5'茎环DNA链为模板，BIP中的B2序列与B2c区域退火，启动链置换合成。Bst DNA聚合酶从B2的3'端延伸，合成新链。外引物B3随后与B3c区域结合并延伸，置换出BIP生成的链。该置换产物的两端（F1/F1c和B1/B1c）互补，形成哑铃状单链DNA结构。循环扩增阶段从该哑铃结构开始，从F1区域的3'端延伸，以自身为模板，将哑铃结构转化为茎环构象，作为后续指数扩增的核心模板。为进一步加速反应，Nagamine等人引入了环引物的概念，包括正向环引物（LF）和反向环引物（LB），它们特异性结合茎环结构上未占据的环区域，启动额外的链置换合成。通过四种引物和环引物的协同作用，内引物持续结合新暴露的F2c和B2c区域，在Bst DNA聚合酶作用下进行反复的引物延伸和链置换，最终生成大量含有靶序列多个反向重复的茎环DNA产物。与等温扩增技术（IATs）相比，LAMP具有开放实验流程和多重检测技术持续优化的优势，使其在广泛采用方面更具优势。

2.2. LAMP的引物设计工具和实际考虑
引物设计是决定LAMP检测特异性、灵敏度和可重复性的关键因素之一。LAMP通常需要四到六条引物，这种多引物结构赋予了高扩增效率和特异性，但也增加了引物间相互作用、形成二级结构和非特异性扩增的概率。因此，合理的引物设计和系统的计算机模拟评估是开发稳健LAMP POCT检测的必要前提。目前已开发出多种软件工具用于LAMP引物设计，包括Primer Explorer、LAMP Designer、LAVA和GLAPD，以及最近开发的LAMPrimers iQ。实际设计中，应仔细考虑几个参数：靶区域应具有足够的特异性；扩增区域通常设计在150-250 bp的中等长度范围内；引物熔解温度应在引物组内平衡；GC含量通常维持在中级范围，应避免长同聚物重复、高度重复序列和稳定发夹结构。避免引物二聚体形成尤为重要，因为多条引物以相对高浓度共存。应筛选候选引物组，通过阳性模板、无模板对照和非靶标模板进行评估，并通过熔解曲线分析、凝胶电泳、测序或序列特异性探针确认扩增产物。在反应优化层面，应系统优化Mg²⁺浓度、甜菜碱浓度、dNTP浓度、反应温度和反应时间。

2.3. LAMP的样本预处理策略
样本预处理是决定LAMP在POCT场景中检测性能的关键因素。尽管LAMP因其等温特性和Bst DNA聚合酶的稳健活性，对常见PCR抑制剂的耐受性更强，但血液、痰液、粪便和废水等复杂生物基质仍对扩增效率和结果可靠性构成重大挑战。最简单的预处理方法涉及直接使用粗样本进行LAMP反应，无需任何核酸纯化，适用于唾液、尿液和鼻咽拭子等相对干净的样本类型。对于需要细胞裂解释放核酸的样本，简单裂解方法（包括热、化学和酶学方法）提供了操作简便性和提高核酸可及性之间的实际平衡。热处理方法广泛用于核酸释放，但回收率低且存在假阳性风险；化学裂解提供了更可靠的替代方案。复杂生物样本，如血液、痰液和粪便，通常需要更严格的预处理，例如磁珠提取、离心柱纯化或结合抑制剂耐受性聚合酶的稀释，以及添加牛血清白蛋白（BSA）以增强系统对残留抑制剂的耐受性。

2.4. 扩增产物的可视化检测策略
在即时检测场景中，结果判读的简便性和直观性对于任何诊断技术的实用性至关重要。LAMP的发展催生了多种扩增产物的可视化检测方法。在LAMP过程中，产生大量焦磷酸根离子（PPi）和质子，相关的物理或化学变化可作为可视化检测的读数。pH指示剂法利用H⁺释放引起的pH降低，通过酚红等染料颜色变化进行裸眼读数，但易受缓冲能力影响且假阳性率较高。浊度法监测白色焦磷酸镁沉淀的形成，无需荧光标记，但灵敏度不足。钙黄绿素是一种独特的金属指示剂荧光染料，反应初期与Mn²⁺结合导致荧光淬灭，随着LAMP进行，积累的焦磷酸根离子竞争性螯合Mn²⁺，释放游离钙黄绿素，随后与Mg²⁺络合，在紫外或蓝光激发下产生黄绿色荧光。荧光检测方法依赖于DNA结合荧光染料，根据读数格式分为实时监测和终点检测。SYBR Green I是最经典的嵌入型荧光染料，选择性结合双链DNA，荧光强度与产物产量正相关。SYTO系列染料作为新一代核酸结合染料，对聚合酶活性的抑制显著低于SYBR Green I，可在反应开始时加入，支持实时监测和终点检测。

3. 整合策略：从单一扩增到系统化检测平台
尽管LAMP凭借其独特的引物设计和链置换扩增机制，能够在等温条件下实现高效核酸扩增，但其转化为真正可靠的POCT工具仍面临一系列系统性挑战，包括非特异性扩增导致的假阳性风险、开管操作造成的气溶胶污染、多重检测的技术困难，以及实验室反应与现场部署工具之间的工程差距。近年来，研究人员通过将LAMP与多种前沿技术深度融合，逐步开发出集成的“扩增-识别-读数”检测平台。

3.1. CRISPR-Cas系统：可编程序列特异性验证
CRISPR-Cas系统是细菌和古菌中的适应性免疫机制，crRNA引导的Cas蛋白精确识别并切割外源核酸。根据效应蛋白的组织方式，CRISPR-Cas系统分为1类和2类，其中2类包括Cas9、Cas12和Cas13。在靶标识别后，Cas蛋白释放非特异性转切割活性，可降解邻近的单链DNA（ssDNA）或RNA报告分子，该切割可通过使用荧光团或FAM/生物素标记的报告分子转化为可检测的荧光或侧流信号。CRISPR系统提供出色的特异性，包括单碱基区分能力，但缺乏内在核酸扩增能力，因此需与LAMP等扩增方法偶联。Cas12a（原名Cpf1）是一种RNA引导的DNA核酸酶，识别富含T的原间隔序列邻近基序（PAM）序列并切割双链DNA（dsDNA）靶标，随后激活对周围单链DNA（ssDNA）报告分子的非特异性转切割。Cas12b是一种热稳定的同源物，其最佳活性温度与LAMP反应范围（60-65℃）重叠，对一锅法LAMP-CRISPR整合特别有价值。LAMP与Cas12系统的整合已在病原体检测中得到广泛探索。在COVID-19大流行期间，Joung等人开发了STOP平台，整合磁珠RNA提取、RT-LAMP扩增和CRISPR-Cas12b检测于单管反应中，临床验证灵敏度达93.1%，特异性达98.5%。该策略已成功扩展至其他病原体检测。Cas13a是一种RNA引导的核酸内切酶，特异性靶向并切割单链RNA（ssRNA），在靶标识别后激活对周围ssRNA报告分子的附带切割。与Cas12a不同，Cas13a不需要PAM基序，使其对RNA病毒检测特别有吸引力。对于LAMP-Cas13整合，RT-LAMP与Cas13a结合为SARS-CoV-2检测提供了高特异性工作流程，但产物转移步骤增加了污染风险。与Cas12和Cas13不同，Cas9主要作为位点特异性DNA核酸内切酶发挥作用，其诊断应用主要利用其高保真顺式切割活性用于序列验证而非信号放大。Bao等人开发了CUT-LAMP，利用Cas9的顺式切割活性，通过引入两碱基修饰赋予扩增子Cas9可识别的PAM位点，在预孵育步骤中精确识别并降解携带PAM位点的污染产物，同时靶DNA因缺乏PAM序列而保持完整。

3.2. PfAgo：无PAM的DNA引导核酸酶
与CRISPR-Cas系统不同，来自激烈火球菌的Argonaute蛋白（PfAgo）是一种DNA引导的核酸内切酶，通过5'-磷酸化引导DNA识别、引导并切割靶基因。PfAgo完全依赖于引导DNA与靶序列之间的碱基配对，无需PAM基序，提供了更大的靶标选择灵活性。LAMP-PfAgo整合检测策略结合了等温扩增的优势和PfAgo的序列特异性DNA切割能力，不仅增强了LAMP的特异性，还实现了多重检测。该策略的核心是多级信号放大和转导机制：首先，常规LAMP实现痕量靶核酸的快速等温扩增；其次，PfAgo通过其严格互补的碱基配对机制精确识别LAMP扩增子，并通过可编程切割将核酸信号转换为可读输出。基于该平台，Pang等人构建了WeD-1手持式等温荧光检测器，实现了水生病原体可视化双靶标检测。Tang等人创新性地将LAMP-PfAgo与反向增强荧光侧流试纸条（rLFTS）结合，建立了比色-荧光交叉验证的LAMP-rLFTS系统。

3.3. 微流控芯片：LAMP的工程平台
微流控芯片作为LAMP的封闭、自动化、微型化工程平台，以三种基本方式贡献于LAMP：(1) 封闭反应环境，大幅降低气溶胶污染风险；(2) 多重并行检测，通过独立反应室设计实现高通量样本分析；(3) 全自动工作流程，将样本处理、核酸扩增和检测整合于单一单元。主动微流控芯片平台依赖外部能量源（如离心力或泵驱动）操控流体，具有高精度、非接触式控制和减少样本消耗等优势。被动微流控芯片平台依赖芯片自身结构（如毛细管通道或亲疏水微图案）结合流体物理性质（如表面张力）驱动液体流动，无需外部设备，具有简单、低成本的优点。近期研究进一步表明，微流控LAMP系统适用于比色检测，并倾向于简化仪器。例如，Sivakumar等人将槲皮素介导的银纳米颗粒（AgNP）形成与LAMP偶联，在可折叠PMMA微器件中实现裸眼检测。Bai等人开发了便携式一体化设备（PAD），集成了免提取样本裂解、冻干试剂珠LAMP、压力平衡自动液体处理和RGB传感器实时比色信号监测。

3.4. 系统集成与智能读数：迈向样本进-结果出
真正的POCT设备需要系统级集成，将扩增、特异性识别和信号转导无缝连接成全自动封闭检测工作流程。多技术集成平台如HARD平台，采用手压驱动微流控芯片整合RT-LAMP和CRISPR-Cas12b检测，无需外部电源。mutaSCAN系统整合了含12-96个反应单元的微流控芯片与RT-LAMP和CRISPR-Cas12a，并配备深度学习算法自动识别反应单元并解读荧光信号。Lift-CM平台采用创新的升降式加热离心机制，双温区设计精确适应LAMP（60-65℃）和CRISPR（37-42℃）反应。此外，PfAgo与LAMP和表面增强拉曼散射（SERS）的协同整合，通过PASS三阶级联扩增策略，实现了单细胞水平的灵敏度。智能读数方面，智能手机和人工智能正将结果解读从主观目视检查转变为客观、定量、可远程访问的分析流程。

3.5. 多重LAMP：策略、挑战与实施路径
多重LAMP策略可分为三大类：空间分离多重检测、荧光或颜色编码多重检测、以及探针/酶辅助多重检测。空间分离多重检测是目前最广泛使用的策略，通过将不同引物组物理分离至独立反应室、通道或液滴中，避免引物间交叉干扰。荧光或颜色编码多重检测通过光谱区分不同靶标扩增子，实现单管多重检测。探针/酶辅助多重检测利用CRISPR-Cas或PfAgo的序列特异性识别能力，对LAMP扩增子进行二级序列水平验证。成功实施多重LAMP需要关注几个关键方面：严格的引物筛选和选择、反应系统的系统优化、包含内部扩增对照、以及加强污染控制。

4. LAMP的多样化应用
LAMP凭借快速、简单、高灵敏度和低设备需求的特点，在临床传染病诊断、精准医学与非传染性疾病检测、食品安全监测以及农业生产与质量监控等多个领域展现出广阔前景和实用价值。

4.1. 临床传染病诊断
传染病持续威胁人类健康。LAMP已广泛应用于病毒、细菌和真菌等病原体检测。在病毒检测中，LAMP实现了与qPCR相当的灵敏度和特异性，同时通过简化提取和便携设备克服了资源受限的技术障碍。在细菌检测中，LAMP在快速分型、高灵敏度和强特异性方面具有显著优势。在真菌检测中，LAMP为快速识别真菌提供了新的技术途径。在非典型病原体和寄生虫检测中，LAMP的应用范围不断扩展，实现了低成本、高灵敏度的快速现场筛查。

4.2. 精准医学与非传染性疾病中的应用
LAMP正超越其在传染病诊断中的传统角色，逐步融入遗传病筛查和肿瘤分子诊断等非传染性疾病领域。在遗传病诊断中，LAMP最成熟的应用是检测已知缺失或热点突变，特别是地中海贫血和血红蛋白病。在肿瘤精准医学中，LAMP可用于DNA甲基化分析、癌基因突变检测以及融合基因检测。

4.3. 食品安全监测
LAMP在食品安全监测中具有快速、简单和适合现场检测的优势，特别是在食源性病原体卫生检验和食品掺假鉴别方面。在食源性病原体快速检测中，LAMP已应用于沙门氏菌、副溶血性弧菌等检测。在食品掺假鉴别中，LAMP结合微流控平台可同时检测多种乳制品成分或肉类掺假。

4.4. 农业生产与质量监控
LAMP正在深刻改变农业生产中的监测和控制模式，为保障食品安全和农产品质量提供技术支持。在水产养殖中，LAMP可同时检测白斑综合征病毒和沙门氏菌。在植物病毒检测中，LAMP整合平台可实现多种植物病毒的并行检测。在转基因作物检测中，LAMP结合CRISPR/Cas12切割或微流控生物传感器，实现了无需纯化、经济且稳健的现场转基因筛查。

5. 从实验室到现场：LAMP大规模POCT实施的商业背景、现有差距及路径
尽管LAMP被广泛认为是POCT场景的有前景替代方案，但尚未实现与集中式qPCR检测或抗原快速检测相媲美的大规模实际应用。当前LAMP在实验室研究和小规模验证中表现强劲，但其广泛实施面临系统性障碍，涵盖检测可靠性、样本兼容性、设备工程、制造、标准化和商业化等方面。商业POCT设备的存在证明了分散式检测的临床和公共卫生价值，但仍存在每测试成本高、依赖专有仪器和耗材、对新兴靶标适应灵活性有限、多重能力受限、与复杂样本基质兼容性不完全、非冷链条件下试剂稳定性不足以及在资源有限环境中可及性有限等未满足需求。LAMP的内在技术壁垒包括多引物系统导致的非特异性扩增、对反应条件的高度敏感性以及从“实验室方法”到“现场可靠工具”转化过程中的系统性挑战。未来发展方向应聚焦于四个相互关联的方面：检测方法设计减少非特异性扩增并提高对复杂基质的耐受性；设备工程侧重于封闭、集成和低成本工作流程；试剂配方实现长期室温储存和简化物流；临床转化需要标准化评估、多中心验证和清晰的监管路径。

6. 本综述的主要贡献与局限性
本综述系统性地概述了LAMP在POCT领域中的技术进展。主要贡献包括：建立了涵盖分子识别、工程实施和系统集成的三层递进分析框架；首次在单一综述中将LAMP应用从传统传染病诊断扩展到精准医学（遗传病、肿瘤学）；提供了对商业POCT产品与实验室研究之间差距的务实分析。本综述的局限性包括技术覆盖广度与深度之间的权衡，以及对PfAgo等新兴技术讨论深度可能不足。此外，像大多数叙述性综述一样，存在发表偏倚的风险。

7. 结论与未来展望
自2000年引入以来，LAMP已成功跨越从概念验证到广泛应用的关键门槛。本综述系统考察了LAMP的基本原理和扩增机制，总结了检测方法的演变，突出了与CRISPR-Cas、PfAgo和微流控的整合策略，并展示了其在传染病诊断、精准医学、食品安全监测和农业检疫中的实际应用价值。尽管实验室研究取得了显著进展，但LAMP在真实世界POCT场景中的大规模应用仍面临巨大差距。随着标准化框架的成熟、多技术的深度整合以及实际应用数据的积累，LAMP有望从实验室中表现优异的分子工具，转化为适用于初级医疗、公共卫生监测和家庭健康管理的实用POCT技术。