微生物基因组中很大一部分基因，称为“unknome”，在功能上尚未被表征。这种遗传“暗物质”代表了微生物学中的一个重大瓶颈，因为它常常被排除在基因组研究之外。研究人员认为，unknome 的很大一部分编码了对于生物相互作用（biotic interactions）关键的功能，这些相互作用是微生物之间或微生物与其宿主之间的复杂对话。这些功能在依赖于简化纯培养的标准实验室条件下很少被观察到。因此，解锁 unknome 需要更加强调生态相关的实验系统。通过共培养（co-culture）和原位分析（in situ analyses）来接纳复杂性，研究人员可以开始破译这一隐藏的遗传库，加深对微生物通讯、适应和进化的理解。关键的是，微生物 unknome 所引发的概念和方法论挑战远远超出了微生物学：未表征基因和蛋白质的平行“暗”部分遍及真核基因组，从植物和动物（包括人类）中支撑新颖性的谱系特异性（孤儿）基因。因此，采用生态和系统级方法来解析 unknome，有可能重新定义研究人员如何在依赖情境、由相互作用驱动的生物系统中将基因型与表型联系起来。
未知功能基因正在挑战我们对遗传构成的理解
在本篇观点文章中，研究人员使用术语“unknome”来指代那些同时缺乏分子或细胞角色的直接实验证据，且与已表征蛋白质缺乏信息性同源性的蛋白质编码基因。根据这一分级操作标准（Vanni et al. 2022），一个预测的未知功能域、自动或假设注释，或情境依赖的功能假设可以优先考虑一个基因，但本身并不能将其从 unknome 中移除：只有当基因的功能得到直接实验验证或基于已表征蛋白质的可靠同源性转移支持时，该基因才离开 unknome。满足这些标准但功能仍然未知的基因，继续代表在基因组和宏基因组中鉴定的蛋白质编码基因的很大一部分，介于40%至60%之间（Vanni et al. 2022）。在培养的细菌中，这一比例变化很大，从20%到86%不等（Lobb et al. 2020）。这种可变性在很大程度上是由于分类学偏见，即研究工作高度集中在少数模式生物（如大肠杆菌
Escherichia coli和枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis）上，以及基因组大小：基因组越大，未知功能基因的比例越高。值得注意的是，即使在大肠杆菌K12（
E. coli K12）中，一个研究最深入的细菌模型之一，约有1600个（约占总数的34%）基因缺乏实验功能证据（“y-ome”），其中111个基因完全没有功能线索（Ghatak et al. 2019）。最近的估计将这个数字减少到738个，仍占基因总数的15.5%（Moore et al. 2024）。对于枯草芽孢杆菌（
B. subtilis），类似的分数（约占总基因的25%）仍然未知（Elfmann et al. 2025）。当然，研究人员不能排除诸如功能未被捕获或传播（“假未知”），或执行相同功能的非同源蛋白质（非同源置换）等因素可能导致了如此大比例的未知功能基因。事实上，“假未知”是指功能实际上已知但在给定基因组注释过程中未被捕获或传播的基因。另一方面，非同源基因置换发生在已知功能由与经典蛋白质无同源性的蛋白质执行时：这样的蛋白质缺乏可识别的直系同源物，因此被标记为“未知”，即使它执行的生化功能已被表征。
大多数基因组和宏基因组研究排除了这一功能未表征的部分，将其发现限制在已知的、保守的途径和必需的内务功能上（Quince et al. 2017）。这种狭隘的关注点构成了遗传学、微生物学和分子生物学研究中的一个主要瓶颈，因为它可能仅仅基于现有知识就对生物体的生物学形成不完整的看法。
为了解决这一空白，研究人员提出了各种实验方法和计算生物学技术来功能性地表征这些未知基因，统称为“unknome”（Rocha et al. 2023）。在真核模型中，反向遗传学方法如RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9基因破坏发挥了重要作用（Rappsilber 2024; Rocha et al. 2023）。在细菌中，正向遗传学方法更常用，包括高通量技术如转座子测序（Tn-Seq）（van Opijnen and Camilli 2013），它将基因功能与生物体在特定实验条件下的适应性联系起来。使用这些方法的研究成功地鉴定了与生物过程相关的先前未知功能基因，这些基因对病原体如鼠疫耶尔森菌（
Yersinia pestis）和达旦提狄克氏菌（
Dickeya dadantii）的感染性至关重要（Eichelberger et al. 2020; Royet et al. 2019）。在更大规模上，一项里程碑式的调查使用随机条形码转座子测序（RB-TnSeq）在数百种条件下对数十种不同细菌中的数千个未知功能基因分配了突变表型，从而提供了候选功能（Price et al. 2018）。
数据驱动的方法依赖于系统发育和计算方法来定义直系同源（Ribeiro et al. 2025）。然而，当没有直系同源物存在并且编码了新的未知功能时，这些方法就会失败。机器学习方法也被使用，尽管最近对酶委员会（EC）编号预测进行重新分类的努力显示了该方法的显著局限性（Dias et al. 2025）。最近，机器学习和语言模型方法迅速发展：对比学习模型改进了酶功能（EC）分配（例如CLEAN; Yu et al. 2023），而混合模态基因组语言模型如gLM2利用保守的基因组邻域背景来检索仅基于序列的搜索会遗漏的功能相关基因（Jha et al. 2025）。这些方法大大扩展了可测试功能假设的空间，但对于支配unknome的真正新颖的谱系特异性基因，仍然最不可靠。多组学数据集的整合提供了另一种对未知基因功能形成假设的方法，将跨组学层的变化与单个基因的变化（例如基因表达的倍数变化）联系起来（Slobodyanyuk et al. 2024）。对于研究深入的模型生物，最近开发的资源Unknome v3数据库（Rocha et al. 2023）系统地编目了未知功能基因，将被忽视的数据转化为新发现的潜在来源。然而，对于研究较少的物种，等效资源仍然基本缺失。
尽管如此，这些实验和计算方法都有一个共同的局限性：它们未能捕捉生态相关性。这种实验设置通常依赖于体外或简化环境，例如合成培养基中的纯培养，这并不能完全代表生物体的生态背景。同样，基于序列同源性或自动注释转移的计算方法往往无法捕获谱系特异性或环境依赖的功能。
相比之下，最近纳入生态或背景数据的方法开始对隐藏的功能多样性产生关键见解。另一个框架最近被开发出来，用于探索unknome在生物体和环境中的相关性，分析了来自约1700个宏基因组和29000个基因组的数据集，包含7100万个未知基因（Vanni et al. 2022）。该研究发现，unknome主要是谱系特异性的且在系统发育上保守，强调了研究这些未知基因对于了解微生物多样化和生态位适应的重要性，正如其他研究也报道的那样（Coelho et al. 2022; Pavlopoulos et al. 2023）。这些最近的研究指出，基因组背景分析和结构比对能够预测环境基因组中发现的新基因家族的功能关联（Rodríguez del Río et al. 2024）。这些家族中的许多与生物相互作用有关，包括抗菌素耐药性、抗菌肽生产和次级代谢产物合成。这些证据的趋同表明，unknome不仅仅是“附属的”，而是对于生态适应至关重要的功能的丰富库，特别是对于生物体之间的复杂对话（Rocha et al. 2023）。
unknome在生物相互作用中的作用？
由于基因功能通常与基因表达相关，识别未知基因表达的条件可以提示它们至关重要的生态背景。在枯草芽孢杆菌（
B. subtilis）中，几个未知功能基因仅在单一或少数培养条件下表达，仅使用约3%的细胞翻译能力（Wicke et al. 2023）。转录组数据和差异表达基因（DEGs）通常包括大量未知基因，有时超过随机预期。这表明转录组学研究中使用的特定实验条件可能激活这一隐藏的遗传库。早期的转录组学研究通过比较固氮共生细菌苜蓿中华根瘤菌（
Sinorhizobium meliloti）在实验室和植物共生条件下的表达，使得能够预测绝大多数基因的功能（Barnett et al. 2001）。因此，转录组数据的使用是优先研究未知功能基因（以及未知功能变异体（Postel et al. 2022））的相关标准。因此，针对特定基因集进行富集分析的方法的实施正变得流行（Mubeen et al. 2022; Zhu et al. 2025）。例如，对枯草芽孢杆菌（
B. subtilis）中在几种培养条件下高表达的41个未知功能基因的表征提供了证据，表明它们大多数具有调控作用（作为RNA结合蛋白）以及在细胞稳态控制中的作用（Wicke et al. 2023）。
然而，这种方法遗漏了许多明显值得进一步研究以全面了解生物体生物学的基因。考虑到这一点，研究人员需要基于给定生物学背景下获得的数据，对值得研究的未知基因进行生物学导向的选择。对细菌适应生物胁迫（如病原相互作用）的研究表明，未知基因可能在免疫逃避、信号传导或营养摄取中发挥作用。例如，在机会性病原体铜绿假单胞菌（
Pseudomonas aeruginosa）中，几个未知基因在感染期间上调，表明它们在毒力或应激反应中起作用（Valli et al. 2020）。在拟南芥（
Arabidopsis thaliana）根合成微生物组的基因组解析的宏转录组学研究（Vannier et al. 2023）中，发现未知功能基因在根定殖期间被激活，表明生态位适应作用。在共生关系中，例如固氮细菌与豆科植物之间，未知基因在共生体生命的关键时刻表达，如固氮和宿主-细菌通讯（Fagorzi et al. 2021; Roux et al. 2014）。在大肠杆菌（
E. coli）中，也发现这些基因在相互作用背景下相关（Morin et al. 2018）。一个特别令人信服的由unknome编码的相互作用功能的例证来自抗噬菌体防御：对聚集在基因组“防御岛”中的先前未知功能基因的系统挖掘导致了众多新型抗噬菌体系统的发现和实验验证（Doron et al. 2018; Gao et al. 2020），这些基因在标准实验室条件下完全保持沉默。
未知基因在生物相互作用过程中的表达突显了它们在专门功能中的潜在作用，这些功能在标准实验室条件下不会显现。例如，将土壤和植物微生物组的微生物成员（如植物共生菌苜蓿中华根瘤菌（
Sinorhizobium meliloti）和土壤真菌木霉（
Trichoderma））进行共培养，揭示了与纯培养相比，未知基因部分具有最高的差异表达（Vaccaro et al. 2024）。在该研究中还观察到，差异表达的未知基因库根据所使用的共生细菌和真菌的菌株而变化，表明unknome不仅可能对微生物生态适应（即与土壤真菌的相互作用）至关重要，而且对菌株特异性识别也是如此。一项类似的研究也得出了相同的结论，其中分析了与不同苜蓿中华根瘤菌（
S. meliloti）菌株孵育后木霉（
Trichoderma）的转录组（Vaccaro et al. 2025）。在这里，令人震惊的是，在真菌木霉（
Trichoderma）中，高达90%的总差异表达基因没有分配功能。
这些例子表明，大量仍未知的基因可能反映了研究人员对微生物生物学的有限看法，这种看法通常局限于培养皿上的纯培养条件。开发新的实验方法来生成功能假设并评估未知基因的表型至关重要。虽然计算研究在限制/优先考虑待研究的未知功能基因数量方面具有明显的高价值，并提供了可测试的假设，但研究人员需要在新方法上获得新的动力，通过建立模拟自然界中存在的条件来培养（图1）（Srinivasan et al. 2024）。
图1：从未知基因到已知功能的整合工作流程。
该循环方法结合了现代实验和计算技术，以系统地表征unknome。（1）发现：该过程始于设计用于模拟自然生态条件的实验，例如共培养、空间和时间分辨研究以及原位分析。通过使用还原论设置和复杂的相互作用模型，可以触发和观察先前未表征基因的表达。（2）优先化与预测：然后对产生的多组学数据进行计算分析，以识别高优先级候选基因并生成关于其功能的可测试假设。网络整合、相关分析和混淆因素校正使得能够生成可测试的功能假设。（3）功能验证：可以使用反向和正向遗传学（以靶向表型测定作为其实验读数）以及与外部数据集比较来验证假设，以确认基因功能。（4）知识整合：最后，将确认的功能整合到公共数据库中，优化注释、预测性计算模型，并最终丰富集体知识。这些更新反馈到后续的发现循环中，逐步将unknome转化为一个信息丰富的框架和推进研究人员对微生物生物学理解的宝贵资源。
这在微生物学的许多领域都是相关的，从传染病到理解和利用微生物组，例如用于可持续农业应用的土壤微生物组（Mapelli et al. 2023），这是本文作者的主要兴趣。在实验室规模条件下重建的微生物群落或宿主-微生物集合体的原位或空间转录组学可能是一种有前景的方法，以获得生物学背景信息丰富的基因表达数据，定义假设性角色，并优先考虑用于研究未知功能基因的反向遗传学方法（Dar et al. 2021; Kalyuzhnaya et al. 2010; Rossi et al. 2018; Sarfatis et al. 2025）。
全球海洋宏转录组学提供了一个清晰的例子，说明环境背景如何塑造转录本库。基于共表达数据，研究人员能够将未知功能基因（占其宏基因组数据集的39%）与已知功能基因聚类，说明温度等局部环境因素如何触发全球海洋中的特定转录组谱，并为海洋微生物unknome提供环境背景（Salazar et al. 2019）。然而，还需要开发和标准化互补方法，如共培养和代理技术（例如，双平板测定、顶层琼脂测定、废培养基测定以及各种高通量方法），以评估相互作用的生理和生化效应并测试突变体（表1）。
表1：揭示unknome内基因功能的策略。
超越微生物学：unknome在遗传学和生物学中的更广泛意义
尽管研究人员关注的是微生物系统，但unknome所提出的概念性问题远非微生物学所特有，并且在当代遗传学和生物学的许多领域引起共鸣。真核基因组拥有自己普遍的“暗”部分。在人类蛋白质组中，大约10%的经典蛋白质编码基因仍然缺乏任何实验验证或同源性预测的功能，定义了所谓的“暗蛋白质组”（dark proteome），这是人类蛋白质组计划的目标（Duek et al. 2018; Perdig?o et al. 2015）。与微生物一样，这些未表征的基因座并非生物学噪音：它们通常在受限的组织、发育阶段或病理条件下表达，并且它们的表征可能有助于缩小基因组注释与疾病机制之间的差距。
一个特别清晰的平行来自进化和比较遗传学。到目前为止研究的每个分类群都包含相当一部分谱系特异性或“孤儿”基因，这些基因在其分支之外缺乏可识别的同源物（Khalturin et al. 2009; Arendsee et al. 2014）。这些分类学上受限的基因远非注释伪影，它们与门和物种特异性的创新有关，从水螅（
Hydra）的刺细胞发育和线虫的自我/非自我识别，到社会性昆虫的等级分化和毒液进化（Khalturin et al. 2009; Johnson 2018）。在植物中，孤儿基因越来越被认为对非生物和生物胁迫反应、次级代谢和作物特异性性状有贡献，因此与植物育种、生态适应和农业遗传学直接相关（Arendsee et al. 2014; Cardoso-Silva et al. 2022）。
最后，unknome代表了进化生物学和合成生物学中一个巨大的、未充分利用的库。正是使这些基因难以注释的谱系和栖息地特异性，使它们成为新型酶、抗菌肽、次级代谢产物和用于生物技术应用的调控模块的有吸引力的候选来源（Pavlopoulos et al. 2023; Rodríguez del Río et al. 2024）。在全生物体（holobiont）框架中，宿主表型来自宿主及其相关微生物组的整合遗传学，宿主和微生物的unknome直接相互作用：破译一个而忽略另一个可能会提供仅部分关于遗传、适应和疾病易感性的看法。
哲学插曲：unknome作为认识论镜子？
对unknome的研究不仅仅揭示了微生物学中的经验空白；它还引起了人们对科学探究本身固有的更深层次认识论局限性的关注（D’Abramo and Neumeyer 2020）。这种大量遗传“暗物质”的持续存在迫使研究人员不仅面对不知道的东西，还面对如何知道。从科学哲学的角度来看，unknome体现了欠定问题（underdetermination），即现有证据不足以区分竞争性假设（Stanford 2023）。一个基因的序列及其在实验室培养中的表达模式不足以确定其功能，因为该功能可能仅从一个复杂的相互作用网络中浮现出来，而该网络在简化的实验系统中缺失。这种对经典还原论方法的挑战并非unknome独有；它在生物学的许多方面都有回响。真核基因组的巨大非编码区曾被斥为“垃圾DNA”，这是对无知的占位符（Dunham et al. 2012）。需要一次概念转变来认识这种“垃圾”是复杂的调控元件，协调基因表达（Fagundes et al. 2022），以及环境因素在不改变DNA序列的情况下在可遗传的表观遗传变化中的重要性（Goldberg et al. 2007; Waddington 1942），以及将生物体视为全生物体（holobionts）的观点（Rosenberg and Zilber-Rosenberg 2014）。在每一个案例中，进步都要求超越对孤立部分的研究。unknome可能代表下一个这样的前沿：当基因角色是情境依赖和多功能性（pleiotropic）时，“一个基因，一个蛋白质，一个功能”的范式就难以为继（van Gestel et al. 2023）。另一方面，发现未知功能基因的适应性景观高度依赖于情境（Price et al. 2018）。严格还原论方法的失败要求转向更全面和系统级的方法论，这些方法论需要接纳生态复杂性（Kesi? 2016）。研究人员认为，当前微生物学的实践，建立在纯培养中的模式生物之上，正面临着一个巨大且不断增长的“异常”，即unknome，它至今未能解决（O’Malley and Boucher 2005）（图2）。对新培养方法和原位转录组学的呼吁不仅仅是要求更好的工具，而是主张一种方法，其中生态背景不是需要控制的变量，而是理解功能的基本框架（Plante 2023）。鉴于此，unknome可以被视为一个库恩异常（Kuhnian anomaly）（Kuhn 1962）：一个持续存在的、未解决的现象，挑战了特定科学领域的基本假设和框架。这种无法解释的观察结果的积累是否可能标志着视角的逐渐转变，其中生态背景和系统级思维成为理解基因功能的核心？
图2：微生物unknome作为认识论镜子。
示意图对比了经典还原论观点，其中基因功能被视为在纯培养中定义的固有“一个基因-一个蛋白质-一个功能”属性（左），与情境依赖的、系统级观点，其中功能从生物体的生态相互作用网络中浮现（右）。unknome——在标准实验室条件下功能不明显的很大一部分基因（40-60%）——代表了持续的“异常”，它推动了重点从编目基因转向理解基因在其实际运作的生态和有机体网络中的功能的逐渐转变。
结论与未来展望
细菌中未知功能的基因可能对适应性过程至关重要，特别是在生物相互作用中。研究人员认为，未知基因部分的一大部分对于在生态背景下支撑微生物-微生物和宿主-微生物相互作用的复杂信号网络至关重要。为了实现这一点，必须开发模拟生态条件的新型实验室模型以及能够从多组学数据集中破译复杂模式的方法。通过将方法创新与生态和系统级视角相结合，研究人员可以开始阐明unknome的全部功能潜力，并推进对“在其生物学背景下”微生物生物学的理解。重要的是，同样的议程远远超出了微生物学。真核基因组中大量“暗”部分的持续存在，从植物、动物和真菌中的孤儿和谱系特异性基因，到人类暗蛋白质组以及仍未解决的意义不确定的变异体（variants of uncertain significance）的解读，表明在整个遗传学和生物学中可能需要一种情境感知、以相互作用为中心的基因功能观点。因此，研究人员不仅将微生物unknome的研究视为微生物学的一个优先事项，而且将其视为进化生物学、医学、植物生物学和合成生物学如何从编目基因转向理解基因在其实际运作的生态和有机体网络中的功能的模型。
