《Biosensors》：Expanding Biolayer Interferometry Applications: Enhanced Accuracy, Precision, and Sensitivity in Residual Biomolecule Detection and Quantitation of Bispecifics and AAV Viral Particles
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生物层干涉技术（BLI）传统上用于通过动力学和定量分析来表征蛋白质与蛋白质（如抗体及其抗原）的相互作用。其灵敏度和已有分析模式的可用性等局限性限制了其在其他分析应用中的普及。本文强调了三个案例研究，展示了BLI向新应用的扩展，涵盖蛋白质检测和病毒载体表征领域。
生物层干涉技术（BLI）传统上用于通过动力学和定量分析来表征蛋白质与蛋白质（如抗体及其抗原）的相互作用。其灵敏度和已有分析模式的可用性等局限性限制了其在其他分析应用中的普及。本文强调了三个案例研究，展示了BLI向新应用的扩展，涵盖蛋白质检测和病毒载体表征领域。第一个案例详细说明了使用多步信号放大方法来实现低丰度分子（如细胞因子）的检测，其检测浓度低于标准单步结合法。将细胞因子夹在生物素化抗体和HRP偶联抗体之间，然后浸入3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）试剂中，从而增强细胞因子检测灵敏度。第二个案例使用BLI对双特异性抗体的混合种群进行定量。评估了桥接和双结合分析模式以评估bsAb抗原结合动力学，并确定样本中正确组装的bsAb比例的能力。在第三个案例中，利用BLI检测原理来估算AAV颗粒混合种群中完整衣壳的百分比。总体而言，这些案例证明了Octet? BLI的多功能性，并强调了其支持超越传统应用的日益广泛的分析流程的潜力。
研究背景与问题：传统的生化分析多依赖于酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹法与高效液相色谱法（HPLC）等技术。近年来，研究趋势迅速向无标记分析技术转变，此类技术能将生物分子相互作用转化为可实时测量的响应信号。无标记系统能够提供实时结合与解离速率常数信息，这对于确定相互作用的全局亲和力至关重要，而ELISA等终点分析法无法实现这一功能。在多种无标记技术中，生物层干涉技术（BLI）通过Octet?平台在抗体滴度测定中广受欢迎，并已成为药物发现上下游重要技术。然而，传统BLI技术在检测低丰度分子时灵敏度不足，此外，双特异性与多特异性抗体等新型药物模式对常规检测提出了挑战，且病毒载体生产过程中常产生空壳与实心衣壳的混合物，现有检测技术往往耗时且昂贵。基于上述问题，为突破传统检测模式的局限，研究人员开展了相关研究以拓展BLI的应用范围。
研究概述：本文展示了三个案例研究，证实通过合理的实验设计与优化，Octet? BLI可成功应用于低丰度细胞因子检测、双特异性抗体均一组分定量及腺相关病毒（AAV）衣壳空壳与实心比例分析。研究表明BLI技术能弥补传统方法在灵敏度和通量上的不足，为生物分子检测和病毒载体表征提供了一种快速且高通量的解决方案，对生物医学研究与诊断的发展具有重要意义，该论文已发表在《Biosensors》。
关键技术方法：研究采用了多步信号放大的酶联夹心法结合Octet?系统进行低丰度分析物的动力学与浓度测定；在双特异性抗体分析中，通过桥接和双结合分析模式在Octet? BLI及Octet? SPR平台上进行抗原结合动力学的实时比较评估；在AAV衣壳检测中，利用密度差异原理，采用Octet? AAVX生物传感器对不同基质中的病毒样本进行直接结合饱和度分析，样本参考标准来源于Progen公司产品。
研究结果：
Octet? BLI信号放大用于低丰度分析物检测
通过多步信号放大实验得出，将样本与HRP偶联抗体步骤预先合并，相较于完全分离的步骤能够在检测TNFα时产生更高的最大信号和更宽的窗口，显著提高了检测灵敏度。在比较3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）与金属增强3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物的研究中发现，尽管DAB在最高浓度下产生更高信号，但AEC在低浓度下具有更优的拟合质量和更低的变异系数（CV），回收率更佳，且毒性更低。研究人员将该方法应用于白细胞介素-6（IL-6）检测，确认了该信号放大工作流程具有广泛的适用性。
使用Octet? BLI进行双特异性抗体检测与定量
在桥接分析模式的研究中得出，由于BLI生物传感器表面为密集二维结构，与表面等离子体共振（SPR）传感器的羧甲基葡聚糖柔性链不同，Zenocutuzumab在BLI平台因空间位阻无法有效结合HER3。在双结合分析模式研究中得出，该模式可成功评估HER2和HER3与Zenocutuzumab的独立结合。当序列结合时，第二抗原的结合响应百分比显著降低，推测可能由于高亲和力或变构效应引起。通过引入缺失功能突变体Her2-hOKT3 BsAb-L进行滴定实验，证实双结合分析模式能够灵敏检测到Zenocutuzumab浓度的变化，适用于评估抗体工程中正确组装的双特异性抗体含量。
使用Octet? BLI检测腺相关病毒（AAV）的空壳与实心衣壳
通过分析得出，利用实心与空壳衣壳之间的密度差异，100%含基因组的实心衣壳在传感器表面的结合饱和度显著高于100%空壳衣壳。通过混合不同比例的参比材料建立标准曲线，可估算未知样本的空壳与实心比例。此外，基质兼容性研究表明，该饱和度检测法适用于多种未经处理的粗裂解液等基质，且无需裂解衣壳暴露DNA即可完成检测。
讨论与结论总结：
Octet? BLI技术已被广泛用于大分子生物制剂的定量与动力学表征，但传统单步法难以检测低丰度分子。本研究证实，通过优化实验设计，BLI可有效拓展至非传统应用领域。对于低丰度分析物检测，优化后的多步结合酶信号放大步骤成功实现了细胞因子的常规检测，相较于传统ELISA，该方法将获得结果的时间大幅缩短至不到30分钟。对于双特异性抗体的分析，双结合模式的数据表明该方法可作为复杂检测技术的有效互补。在AAV衣壳检测中，基于密度差异的检测方法避免了繁琐低效的衣壳裂解步骤。该方法要求基因组插入片段足够大以保证信号差异，且样本衣壳滴度需调整至标准品水平并使用充分表征的参比样本。总体而言，该研究提出的方法可作为分析超速离心（AUC）和冷冻电子显微镜等成熟技术的正交验证手段，并有望将BLI技术的应用扩展至细胞与基因治疗领域。
