《Pharmaceutics》：Hybrid Drug Delivery System Designed from Spatiotemporal Hierarchical Controlled-Release Strategy Co-Delivering Rutin and Resveratrol for Coordinated Anti-Tumor Immunotherapy
编辑推荐：
背景：高度异质性和动态演变的肿瘤微环境（TME）导致传统疗法产生耐药性和复发。尽管免疫治疗展现出独特优势，但其临床效用仍受限于次优的免疫原性和单一疗法的有限效果。为此，研究人员提出了一种基于时空层级控释策略的杂化药物递送系统，以实现免疫检查点阻断（ICB）和免
背景：高度异质性和动态演变的肿瘤微环境（TME）导致传统疗法产生耐药性和复发。尽管免疫治疗展现出独特优势，但其临床效用仍受限于次优的免疫原性和单一疗法的有限效果。为此，研究人员提出了一种基于时空层级控释策略的杂化药物递送系统，以实现免疫检查点阻断（ICB）和免疫原性细胞死亡（ICD）双重免疫治疗，促进协同抗肿瘤治疗。方法：利用由二油酰磷脂酰乙醇胺/琥珀酰胆固醇组成的脂质双层构建脂质体-胶束杂化药物递送系统（RUT-RPP-LP），以包封芦丁（RUT），并形成内腔包裹白藜芦醇胶束（RPP）。研究人员对RUT-RPP-LP进行了表征，并研究了其pH敏感性和释放行为。随后，构建了结肠癌荷瘤小鼠模型，以评估体内靶向抗肿瘤效果和生物安全性。在此基础上，初步探索了ICB和ICD的联合机制。结果：RUT-RPP-LP具有优异的制剂特性、稳定性和生物相容性，可通过分别响应TME和溶酶体酸性实现药物的分级控释。显然，RUT-RPP-LP能特异性靶向肿瘤部位，诱导ICD发生，并同时阻断PD-1/PD-L1免疫检查点信号通路，从而增强T细胞功能并诱导肿瘤细胞凋亡。结论：基于层级控释策略的RUT-RPP-LP发挥了时空协同增强抗肿瘤免疫的作用，可能为克服实体瘤免疫治疗低响应率提供一种新型组合策略。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
恶性肿瘤是全球主要死因之一，其治疗难点在于肿瘤微环境（TME）的高度异质性和动态演变，导致传统疗法易产生耐药和复发。免疫治疗，特别是免疫检查点阻断（ICB）疗法，通过解除T细胞抑制信号，部分延长了患者生存期。然而，单一ICB疗法面临响应率低、免疫相关不良反应及免疫原性不足等问题。研究表明，将ICB与免疫原性细胞死亡（ICD）诱导剂联合，可通过级联反应激发协同免疫。芦丁（RUT）和白藜芦醇（RES）是两种传统中药中的多酚类活性成分，分别具有下调PD-L1表达（ICB）和诱导ICD的潜力，但其水溶性差、生物利用度低，限制了临床应用。因此，如何实现RUT和RES的高效共递送并精确调控其时空释放，成为发挥免疫协同作用的关键挑战。
**研究概述与结论**
为此，研究人员基于前期研究，构建了一种新型pH响应双药共载杂化递送系统——RUT-RPP-LP，即脂质体-胶束杂化（LMH）系统。该系统利用脂质双层（由二油酰磷脂酰乙醇胺/琥珀酰胆固醇组成）包封RUT，并在内腔装载RES胶束（RPP）。通过利用增强渗透滞留（EPR）效应实现被动靶向，并根据肿瘤内外不同酸性环境（TME pH 6.8和溶酶体pH 5.5）实现时空层级控释：首先在TME中释放RUT以阻断PD-1/PD-L1通路，随后RPP被肿瘤细胞摄取，在溶酶体中释放RES以诱导ICD。体外和体内实验表明，RUT-RPP-LP具有良好稳定性、生物相容性和pH响应性，能特异性靶向肿瘤部位，显著抑制肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠生存期。机制上，RUT-RPP-LP通过下调PD-L1表达、诱导CRT暴露和HMGB1释放，以及增强TNF-α和IFN-γ分泌，实现ICB与ICD的协同。该研究发表于《Pharmaceutics》，为克服实体瘤免疫治疗低响应率提供了新策略。
**主要关键技术方法**
研究人员采用薄膜分散法制备了RUT-RPP-LP，即先通过迈克尔加成反应合成聚（β-氨基酯）（PBAE）和聚乙烯亚胺-聚（β-氨基酯）（PP）共聚物，再自组装制备RES胶束（RPP），最后将RUT和RPP与脂质（DOPE/CHEMS）混合，通过旋转蒸发和超声水化形成杂化脂质体。使用动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）表征粒径、电位和形态；高效液相色谱（HPLC）定量药物含量和释放；在体外模拟不同pH（7.4、6.8、5.5）环境评估pH响应释放行为；体内实验采用Balb/c小鼠（雌性，6-8周龄，20±2 g）皮下接种CT26结肠癌细胞建立荷瘤模型，通过尾静脉注射给药，评估生物分布、抗肿瘤疗效和安全性。样本队列来源为辽宁长生动物中心。
**研究结果**
**4.1. RUT-RPP-LP的表征**
4.1.1. 形态与DLS分析：TEM显示RUT-RPP-LP呈球形，粒径均匀，平均粒径218.88 nm，PDI 0.187，满足EPR效应被动靶向要求。Zeta电位为-4.56 mV，表明阳离子RPP与阴离子脂质膜静电中和。
4.1.2. 储存稳定性：4°C保存15天，RUT累积泄漏<12%，RES<3%，粒径和PDI变化微小，表明制剂结构稳定。
**4.2. 体外pH敏感性评价**：在pH 7.4时粒径稳定；pH 6.8时粒径先增大后减小，表明脂质双层部分解离释放RUT；pH 5.5时粒径迅速减小至<100 nm，表明胶束解离释放RES，实现层级控释。
**4.3. 体外pH释放研究**：动态透析法显示，pH 7.4时72 h内RUT和RES累积释放仅23%和8%；pH 6.8时RUT快速释放80%（24 h），RES<20%；pH 5.5时RES释放达80%（24 h），证实了pH依赖性分级释放。
**4.4. CCK-8实验**：空白载体对3T3和CT26细胞毒性低（存活率>85%），RUT-RPP-LP对CT26细胞增殖抑制效果最强，IC50值最低，优于游离药物和单药纳米制剂。
**4.5. 体内靶向递送与滞留**：DiR标记的RUT-RPP-LP尾静脉注射后，肿瘤部位荧光信号随时间增强，肝肾荧光弱于游离DiR组，表明通过EPR效应实现高效肿瘤靶向。
**4.6. RUT-RPP-LP的体内治疗效果**
4.6.1. 抗肿瘤效果：RUT-RPP-LP组肿瘤体积增长最慢，肿瘤抑制率（TIR）最高，显著优于游离RUT+RES、RUT-LP和RPP-LP组。
4.6.2. 治疗质量：各组小鼠体重正常增长，RUT-RPP-LP组中位生存期显著延长，无明显毒性表现。
4.6.3. H&E染色：RUT-RPP-LP组肿瘤组织坏死范围最大，而主要器官未见病理损伤，证明生物安全性良好。
**4.7. RUT-RPP-LP的协同作用**
4.7.1. 肿瘤细胞增殖与凋亡：Ki-67染色显示RUT-RPP-LP组增殖指数（PI）最低（9.11%），TUNEL染色显示凋亡指数（AI）最高，表明强效抑制增殖并促进凋亡。
4.7.2. CRT、HMGB1和PD-L1表达水平：免疫组化（IHC）显示，RUT-RPP-LP显著增加CRT膜暴露和HMGB1释放（ICD标志），并降低PD-L1表达（ICB标志），效果分别依赖于RPP和RUT。
4.7.3. 关键效应分子水平：ELISA检测肿瘤组织中TNF-α和IFN-γ水平，RUT-RPP-LP组最高，表明激活了效应T细胞功能。
**讨论与结论**
讨论部分指出，RUT-RPP-LP通过时空层级控释实现了ICB与ICD的协同，增强了抗肿瘤免疫。该系统的优势在于：利用LMH结构改善药物稳定性并实现pH响应释放；通过EPR效应实现肿瘤靶向；RUT下调PD-L1解除免疫抑制，RES诱导ICD增强免疫识别，两者互补形成正反馈循环。结论部分（翻译）：总之，本研究构建了一种新型时空层级控释递送系统RUT-RPP-LP，充分发挥了RUT和RES的免疫调节潜力，实现了恶性肿瘤的ICB/ICD协同治疗。RUT-RPP-LP呈球形均匀、分散性好、长期稳定，具有pH响应性释放特性：在生理pH下稳定，但在酸性TME和溶酶体中释放药物。体内肿瘤抑制研究表明，RUT-RPP-LP具有良好的生物相容性、高效的肿瘤靶向性和强大的抗肿瘤功效。机制上，其治疗活性与下调肿瘤细胞PD-L1表达、诱导CRT膜暴露、HMGB1细胞外释放以及增强关键免疫效应细胞因子分泌相关。总之，RUT-RPP-LP实现了时空协调的ICB/ICD协同增效，提高了草药成分的生物利用度，并提供了一种有前景的组合免疫治疗策略。研究仍存在局限性：ICD诱导与肿瘤内免疫细胞浸润增强的因果关系需实验验证；RUT与RES的最佳协同剂量需优化；缺乏体外机制验证实验；未来应考虑雄性模型排除性别干扰。
