《Pharmaceutics》：Optimization of Therapeutic modRNA Delivery to the Lung for Prevention of Pulmonary Fibrosis
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背景/目的：肺纤维化是一种进行性致命疾病，以过度的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）沉积和不可逆的肺重塑为特征。尽管修饰mRNA（modified mRNA, modRNA）疗法为调控疾病驱动通路提供了有前景的策略，但由于常规脂质
背景/目的：肺纤维化是一种进行性致命疾病，以过度的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）沉积和不可逆的肺重塑为特征。尽管修饰mRNA（modified mRNA, modRNA）疗法为调控疾病驱动通路提供了有前景的策略，但由于常规脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）固有的肝脏趋向性，有效的肺部递送仍具挑战。本研究旨在建立一个优化的平台，用于肺选择性modRNA递送及肺纤维化的治疗筛选。方法：研究人员在体内评估了一系列电荷修饰的LNP配方在系统性给予荧光素酶（Luciferase, Luc）modRNA后的肺部趋向性。评估了给药途径、在健康及博来霉素（Bleomycin, BLM）诱导的纤维化肺中的生物分布，以及内源性微RNA（microRNA, miRNA）介导的去靶向策略。随后在正常人类肺成纤维细胞（Normal Human Lung Fibroblasts, NHLFs）中评估了靶向转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-beta, TGF-β）信号通路的候选抗纤维化modRNA。结果：在测试的配方中，50% DOTAP MC3 LNPs在肺部转染、理化性质和有限的脱靶表达之间表现出最有利的平衡。静脉（Intravenous, IV）给药相较于气管内（Intratracheal, IT）给药实现了稳健的肺部表达且具有更优的安全性。重要的是，尽管存在广泛的组织重塑，肺部生物分布在BLM诱导的纤维化肺中得以保留。整合miR-122识别位点进一步增强了选择性，导致94.5%的总转基因表达定位于肺部，同时大幅降低了残留的肝脏表达。体外筛选确定显性负性TGF-β受体II（Dominant-negative TGF-β receptor II, DNTGFBR2）modRNA是TGF-β诱导的纤维化激活的有效抑制剂，显著抑制了α-SMA和CTGF的表达。结论：这些发现通过整合肺选择性LNP工程、最优系统性递送、miRNA介导的去靶向和治疗载荷筛选，建立了肺modRNA治疗开发的综合平台。该策略为开发针对肺纤维化及其他器官特异性疾病的靶向RNA疗法奠定了基础。
该研究发表于《Pharmaceutics》。目前肺纤维化是一种由肺泡上皮反复损伤引发失控伤口愈合级联反应导致的进行性疾病，其特征是驻留成纤维细胞过度活化分化为肌成纤维细胞，引起过量细胞外基质（ECM）沉积，现有FDA批准的小分子药物如吡非尼酮和尼达尼布仅能延缓进展且伴有全身毒性。修饰mRNA（modRNA）具备避免病毒预存免疫、包装限制和基因组整合风险及剂量可控等优势，但常规脂质纳米颗粒（LNP）因载脂蛋白E（ApoE）相互作用固有肝脏趋向性，成为肺部有效递送的主要障碍，且纤维化组织的胶原束、灌注受限等物理屏障可能影响纳米颗粒渗透。为此，研究人员旨在建立优化平台，通过肺选择性modRNA递送与治疗筛选解决上述问题。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：合成并表征多种电荷修饰的modRNA-LNP复合物如Lipid 5、iPLNP、50% DOTAP 5A2SC8及50% DOTAP MC3 LNPs并检测粒径、多分散指数（PDI）和包封率（EE）；使用雄性C57BL/6小鼠通过静脉（IV）、腹腔（IP）或气管内（IT）给药进行体内modRNA递送与生物分布分析，利用IVIS Spectrum成像系统定量荧光素酶（Luc）表达；通过Ai14报告小鼠结合流式细胞术（FACS）分析肺内细胞转染谱；采用博来霉素（BLM）诱导雄性C57BL/6小鼠肺纤维化模型并作组织学评估与羟脯氨酸定量；在正常人肺成纤维细胞（NHLFs）中利用JetMessenger转染modRNA并经TGF-β1刺激建立体外纤维化模型，通过qPCR和免疫荧光（IF）分析α-SMA与CTGF基因表达。
研究结果如下：
3.1. Comparative In Vivo Screening of LNP Formulations for Pulmonary Tropism。研究人员通过比较体内筛选不同LNP配方发现，Lipid 5 LNP局限于肝脏，iPLNP及两种50% DOTAP候选物肺部趋向性更高，但iPLNP包封率低，50% DOTAP 5A2-SC8 LNP脾脏脱靶积累过多，最终确定50% DOTAP MC3 LNP兼具优良理化性质、强肺部转染及最小肝脾心脱靶信号，且在Cre依赖荧光报告小鼠中证实其能广泛转染肺内皮、上皮及免疫细胞。
3.2. Evaluation of Administration Routes for Pulmonary Delivery。研究人员评估给药途径发现，静脉（IV）给药肺部绝对表达最高且生物分布由肝转向肺，腹腔（IP）主要弥散于腹器，气管内（IT）虽集中于肺但死亡率高伴严重组织损伤与急性炎症，IV给药则维持血清肝酶及免疫细胞在正常范围，表明IV在转染效率与全身耐受间平衡更优。
3.3. Evaluation of LNP Delivery Efficacy in a BLM-Induced Pulmonary Fibrosis Model。研究人员在BLM诱导纤维化模型中于第10天IV给予50% DOTAP MC3 LNPs，第21天羟脯氨酸检测与Masson三色染色证实纤维化形成，但第11天离体生物发光定量显示病损与对照组肺部放射强度无显著差异，证明病变微环境不影响该LNP的肺部递送效力。
3.4. Refinement of Pulmonary Selectivity via Endogenous MicroRNA-Mediated De-Targeting。研究人员在modRNA中整合内源性miRNA识别位点发现，标准Luc在肺肝均显著表达，含miR-122位点的Luc122显著选择性削减肝脏信号，含miR-122与miR-143双位点的Luc122-143虽完全抑制肝脾肾脱靶却也显著降低肺部表达，故单miR-122过滤是优化肺趋向性的最佳去靶向策略。
3.5. Screening of Candidate Therapeutic Genes in an In Vitro Model of TGF-β-Induced Fibrosis。研究人员在TGF-β诱导NHLFs纤维化体外模型中筛选候选治疗基因发现，SMAD7与显性负性TGF-β受体II（DNTGFBR2）modRNA均能阻止α-SMA应力纤维形成，但DNTGFBR2在抑制α-SMA与CTGF转录上优于SMAD7，被确定为更有效阻断TGF-β介导纤维化活化的治疗载荷。
讨论部分总结：研究人员指出系统性核酸递送的主要障碍是常规LNP固有肝脏趋向性，引入永久阳离子脂质DOTAP可改变蛋白冠形成使生物分布转向肺部，50% DOTAP MC3属选择性器官靶向（SORT）纳米颗粒且具良好理化与转染特性及广泛肺细胞转染谱。IT给药虽局部表达高但伴毒性和组织损伤，IV更安全优选。BLM模型虽达ECM峰值沉积但未完全模拟人进行性纤维化，单时间点评估后需多阶段追踪。miR-122位点有效抑制残留肝表达且保留肺翻译，未来需评估纤维化各阶段肝miR-122稳定性及重复给药影响。研究整合递送优化与治疗筛选，DNTGFBR2较SMAD7在上游阻断TGF-β受体活化更具效抑制促纤维化信号。局限包括缺Zeta电位、形态、血清稳定性等表征，缺modRNA组织定量及蛋白印迹、内吞逃逸直接评估，缺长期动力学与重复给药及DNTGFBR2体内治疗评价及抗PEG免疫等考察。结论翻译为：这些发现通过整合肺选择性LNP工程、最优系统性递送、miRNA介导的去靶向和治疗载荷筛选，建立了肺modRNA治疗开发的综合平台。该策略为开发针对肺纤维化及其他器官特异性疾病的靶向RNA疗法奠定了基础。
