利用小鼠生物测定评估6-脱氧河豚毒素的毒性及其在河豚体内的分布

《Marine Drugs》：Toxicity Assessment of 6-Deoxytetrodotoxin by Mouse Bioassay and Its Distribution in Pufferfish

　　

河豚毒素（TTX, 1）是一种强效神经毒素，广泛存在于多种海洋和陆生生物中。6-脱氧TTX（2）作为低丰度TTX类似物从河豚中分离出来。尽管主要TTX类似物的毒性已被研究，但由于纯化或合成6-脱oxyTTX的获取量有限，其急性毒性和生物分布仍不清楚。在本研究中，基于小鼠生物测定评估了6-脱oxyTTX的急性毒性。6-脱oxyTTX的毒性估计为1 MU = 570 ng，LD99值为28 μg/kg。通过与TTX的LD99值（10 μg/kg）进行比较，估计6-脱oxyTTX的相对效力为0.36，表明其毒性高于其他脱氧类似物。此外，高分辨率LC-MS分析揭示了在Takifugu、Arothron和Lagocephalus属的有毒河豚物种中6-脱oxyTTX的出现。尽管6-脱oxyTTX的浓度通常远低于TTX，但由于其相对较高的急性毒性，6-脱oxyTTX应被视为具有毒理学相关性的类似物。这些结果表明，6-脱oxyTTX是一种具有相对较高毒性的低丰度TTX类似物，为食品安全评估和TTX类似物在河豚中的分布提供了新信息。

河豚毒素（TTX）作为一种强效且高选择性的电压门控钠离子通道阻滞剂，广泛存在于多种海洋与陆生生物中，常因食用含有该毒素的生物（尤其是河豚）而引发致命的食物中毒。尽管TTX的主要类似物毒性已被广泛研究，但6-脱氧河豚毒素（6-deoxyTTX）由于在自然环境中丰度极低且缺乏商品化或合成标准品，其急性毒性和在生物样本中的分布情况一直不明确。为填补这一毒理学数据空白并为食品安全评估提供更全面的参考，研究人员对6-deoxyTTX的急性毒性及其在河豚体内的组织分布开展了深入研究。本研究成功评估了6-deoxyTTX的急性毒性，发现其具有较高的毒理学相关性，并揭示了其在多种有毒河豚中的分布特征。这项研究成果发表在海洋药物领域的权威期刊《Marine Drugs》上，对于完善TTX类似物的食品安全风险评估体系以及理解TTX类化合物的生物积累与 biosynthetic pathway具有重要意义。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下几种方法：首先，利用小鼠生物测定法，按照日本官方河豚毒素分析标准，对纯化得到的6-deoxyTTX进行了急性毒性评估，并据此计算其小鼠单位和致死剂量；其次，采用高分辨率亲水作用液相色谱-质谱联用技术，对来自Takifugu、Arothron和Lagocephalus三个属的10种河豚（共20个个体）的皮肤、肝脏和性腺等组织样本，以及一种含有TTX的海洋扁虫样本进行了毒素定量与组成分析；最后，基于冷冻电子显微镜解析的钠离子通道结构，利用分子可视化技术探讨了TTX及其类似物在外孔 vestibule 结合环境中的构效关系。

在小鼠生物测定6-deoxyTTX的研究中，研究人员通过腹腔注射不同剂量的纯化6-deoxyTTX（纯度87.9%，主要杂质为低毒性的4-epiTTX和4,4a-anhydroTTX）对小鼠进行实验。结果显示，小鼠出现了活动减少、共济失调、抽搐和喘息呼吸等典型的TTX中毒症状。根据小鼠体重和死亡时间计算得出，6-deoxyTTX的毒性效价为1 MU = 570 ng，其LD99值估算为28 μg/kg。与TTX的LD99值（10-12 μg/kg）相比，6-deoxyTTX的相对毒效力约为0.36，证明了其毒性显著高于11-deoxyTTX和6,11-dideoxyTTX等其他脱氧类似物。

在河豚体内TTX和6-deoxyTTX的浓度分析方面，高分辨率LC-MS分析结果表明，TTX在所有受检的20个河豚个体中均被检出，而6-deoxyTTX则在除了T. rubripes和T. vermicularis以外的8种河豚中被广泛检测到。尽管6-deoxyTTX的分布广泛，但其浓度显著低于TTX。在37个检测出6-deoxyTTX的组织样本中，其相对于TTX的丰度比例普遍较低，范围在0.23%至13.4%（w/w）之间，平均值为3.2%。没有发现任何特定的河豚物种或组织会优先积累6-deoxyTTX，同时在有毒扁虫样本中，6-deoxyTTX的丰度也仅占TTX含量的约2%。

在讨论部分，研究人员对6-deoxyTTX的急性毒性和相对效力进行了深入分析。研究指出，尽管受限于纯品数量，小鼠生物测定得到的数据为近似估计值，但结合Neuro-2a细胞实验结果，6-deoxyTTX在脱氧型类似物中保留了相对较高的毒性，其相对毒效力与结构特征高度吻合。

关于6-deoxyTTX及相关类似物毒性的结构解读，研究人员基于冷冻电镜结构指出，TTX通过其胍基和多个羟基结合在Nav通道外孔的筛滤器周围。C11位的羟基被认为与结构域IV中的保守Asp残基发生关键相互作用，因此缺乏C11羟基的类似物毒性大幅下降；而C6位的羟基及其立体化学排列同样对毒性有贡献。6-deoxyTTX虽然失去了C6位羟基，但其含胍基的骨架、C11位的羟甲基以及剩余的羟基足以维持其与Nav通道的较强相互作用，从而解释了其在脱氧类似物中具有相对较高毒性的原因。

针对6-deoxyTTX在河豚及其他海洋生物中的发生率及其生物合成意义，研究结果表明，尽管其在多数受检河豚中的相对丰度较低，对整体毒性的贡献可能有限，但考虑到其相对较高的急性毒性，在毒素分析中仍应将其纳入监测范围。此外，6-deoxyTTX在多种海洋生物中的低浓度检出，进一步支持了此前提出的关于TTX逐步氧化的生物合成途径假说。

总结研究结论部分，本研究评估了毒理学特征尚不明确的低丰度类似物6-deoxyTTX的急性毒性与生物分布。小鼠生物测定显示，与已报道的其他TTX类似物相比，6-deoxyTTX具有较高的急性毒性，凸显了其在食品安全方面的重要性。HR-HILIC–LC–MS分析进一步揭示了该物质存在于Takifugu、Arothron和Lagocephalus属的多种有毒河豚中。在所检测的河豚样本中，6-deoxyTTX的丰度通常远低于TTX，表明其在这些样本中对总体毒性的贡献有限。然而，由于其相对较高的毒性，6-deoxyTTX仍应被视为具有毒理学相关性的类似物。未来需要在更广泛的生物体、物种、地理区域和季节中开展进一步研究，以更好地理解TTX相关化合物的分布、积累及其生物合成起源。