综述：通过局部药物递送系统赋能细胞外囊泡伤口治疗：机制洞察与先进刺激响应策略

《Gels》：Empowering Extracellular Vesicle Wound Therapy via Local Drug Delivery Systems: Mechanistic Insights and Advanced Stimuli-Responsive Strategies

　　

细胞外囊泡（EVs）因其调节炎症反应、促进血管生成和增强组织再生的显著能力，已成为有前景的无细胞治疗剂用于伤口愈合。这些生物纳米载体向受体细胞递送生物活性货物，包括调节性miRNA、蛋白质和脂质，从而调节控制组织修复的关键信号通路。然而，基于细胞外囊泡（EV）的疗法的临床转化受到递送效率挑战的显著限制。局部药物递送系统（LDDSs）提供了几个关键优势，包括减少网状内皮系统清除、增强向伤口部位的生物分布、延长局部停留时间以及精确的空间靶向治疗效果。本综述系统总结了基于EV的伤口修复疗法的最新进展，特别关注原位形成和可植入的LDDSs，如刺激响应水凝胶。研究人员综合讨论了EV在伤口修复所有阶段促进愈合的分子和细胞机制。此外，研究人员批判性地评估了这些递送平台的演变，从传统的被动释放系统到先进的刺激响应水凝胶和微针系统，评估了它们的设计原理以及与EV生物学的整合。研究人员还讨论了关键的转化挑战和机遇：可扩展制造、标准化质量控制和监管途径，为EV-LDDS混合体在精准再生治疗中的临床实施提供了前瞻性观点。

1. 引言

人类皮肤作为关键保护屏障，动态维持内环境与外环境的稳态。尽管具有内在修复能力，但皮肤伤口愈合在损伤后显著受损，尤其是生理功能受损的情况下，进程复杂且常拖延。传统伤口管理策略（如清创、一期闭合和抗菌敷料）主要针对感染控制和临时组织支持，但对慢性或复杂伤口（如糖尿病足溃疡和全层烧伤）疗效有限。干细胞虽在再生医学中占据核心地位，但受限于同种异体免疫排斥、不可预测的分化轨迹（如畸胎瘤形成）以及冷冻保存稳定性等问题。细胞外囊泡（EVs，30–150 nm）作为由多种细胞（尤其是间充质干细胞（MSCs））分泌的纳米级结构，已成为有前景的无细胞治疗剂。EVs继承母细胞的再生信号库，同时消除了全细胞给药相关的安全性风险。其磷脂双分子层膜赋予生物稳定性，并通过受体介导的内吞和膜融合将功能性生物活性分子（如调节性miRNA、免疫调节蛋白和脂质介质）递送至受体细胞，从而调控下游效应：抑制过度炎症、时空控制血管生成、平衡成纤维细胞活化和迁移、调节胶原合成及细胞外基质（ECM）重塑。尽管具有这些优势，全身性递送（尤其是静脉注射）仍因网状内皮系统快速清除、伤口部位生物分布差、EV滞留率低及脱靶效应而欠佳。因此，局部药物递送系统（LDDSs）成为必要：它们实现伤口床的时空控制释放，最大化局部生物利用度，同时最小化全身暴露和毒性。LDDSs兼具双重功能：作为保护性载体保持EV完整性和生物活性，以及作为仿生3D支架提供机械线索和结构引导。近年来，多刺激响应递送系统、仿生纳米复合物和可扩展制造方法标志着EV介导伤口治疗的范式转变。本综述批判性评估EV整合的伤口愈合平台的最新进展：首先阐述EV介导组织修复的分子和细胞机制；其次全面评估各类LDDSs，包括传统水凝胶、刺激响应水凝胶和微针，强调其设计原理、释放动力学及与EV生物学的功能整合；最后讨论可扩展制造、质量控制和监管标准化方面的转化挑战与机遇，为EV-LDDS混合体在精准再生治疗中的临床实施提供前瞻性视角。

2. 伤口愈合机制

皮肤伤口愈合经历四个重叠且紧密协调的阶段：止血、炎症、增殖和重塑。止血是最早且最短暂的阶段，损伤后立即启动：血小板黏附和聚集触发凝血酶生成并释放生物活性介质（如PDGF、TGF-β和血清素），募集成纤维细胞并刺激早期胶原合成。随后的炎症阶段以血管扩张、血管通透性增加、中性粒细胞浸润和巨噬细胞极化为特征，不仅清除碎片和病原体，还通过细胞因子介导的串扰协调向增殖的转变。增殖阶段始于损伤后约72–96小时，于第4–7天达到高峰，表现为角质形成细胞迁移（再上皮化）、成纤维细胞增殖、血管生成和肉芽组织形成。最后，重塑阶段持续数月到数年：III型胶原逐步被机械性能更强的I型胶原替代；肌成纤维细胞通过肌动蛋白-肌球蛋白驱动的张力介导伤口收缩，并调节ECM稳态。伤口愈合是一个动态的反馈调节级联，精确的时空协调对于及时愈合至关重要，其失调导致各种形式的愈合受损。

3. 细胞外囊泡（EVs）在伤口愈合中的作用

3.1. EVs在伤口愈合中的分子机制

组织修复和再生由生长因子与特定细胞表面受体结合触发，从而引发细胞迁移、血管生成、再上皮化、ECM沉积和组织重塑等关键细胞反应。EVs主动调节伤口愈合的所有阶段：减轻过度炎症、刺激血管生成、增强细胞迁移和增殖、促进胶原合成以及引导ECM重塑以减少病理瘢痕。例如，间充质干细胞来源的外泌体抑制B和T淋巴细胞增殖，下调促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6），并通过降低巨噬细胞中PKNOX1的表达促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化，从而减弱局部炎症反应。EVs还刺激成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成，例如通过PI3K/Akt信号通路促进皮肤伤口愈合。血管生成方面，EVs携带促血管生成蛋白和调节性RNA，被内皮细胞摄取后激活PI3K/AKT、MAPK/ERK和Notch信号通路，增强内皮增殖、迁移和管形成，从而促进伤口床功能性新血管形成。此外，3D培养的间充质干细胞来源的外泌体富含miR-150-5p，通过靶向PDCD4促进角膜上皮和基质细胞增殖并抑制炎症细胞因子释放。在糖尿病伤口模型中，EVs调节伤口微环境中的葡萄糖代谢，代表一种双重作用策略。EVs还抑制肌成纤维细胞聚集，减少瘢痕形成，通过调节ERK/MAPK通路和MMP3/TIMP1比率来调节ECM重塑。hBM-MSC来源的外泌体可通过抑制TGF-β1/SMAD信号通路抑制肌成纤维细胞分化和瘢痕形成。

3.2. 治疗性EVs的标准化与质量控制

基于EV的伤口疗法的临床转化关键依赖于EV生产的可重复性及其理化与生物学性质的严格表征。根据MISEV指南，需对来源细胞、分离方法和多参数表征进行全面评估。

3.2.1. 来源细胞和培养条件

EVs的生物货物和治疗功效由其母细胞决定。对于伤口愈合，MSCs（尤其是来自脂肪组织（ADSCs）、骨髓（BMSCs）和脐带（hUCMSCs）的细胞）是最常用的来源细胞，因其强大的旁分泌信号、免疫调节能力和血管生成潜能。此外，内皮祖细胞、角质形成细胞和血小板来源的EVs也用于阶段特异性功能。培养条件（如2D/3D培养、缺氧/常氧预处理和传代次数）显著影响EV分泌速率和货物装载（如miRNA和蛋白质谱），因此需严格标准化来源细胞制造过程。3D培养系统和生物反应器技术的进步正实现临床级MSC-EVs的更可扩展和可重复生产。

3.2.2. 分离方法

分离技术的选择直接影响EV产量、纯度和下游功能。超速离心法产量高但剪切力大，可能损害完整性，且沉淀物共沉淀非EV蛋白和脂蛋白，纯度较低。密度梯度离心法（使用碘克沙醇）通过浮力密度分离实现高纯度，但耗时且产量低。尺寸排阻色谱法基于尺寸分离，保持囊泡完整性和生物活性，重现性好，但需浓缩步骤。切向流过滤法（TFF）可大规模、符合GMP生产，保持EV完整性，但难以分离相似尺寸的颗粒。新兴的亲和法（如使用工程化肽或DNA微花）可在数分钟内从复杂生物液体中实现高纯度EV富集。

3.2.3. 表征：粒径、浓度和表面标志物

严格表征需互补技术验证EV身份。粒径和浓度方面，纳米颗粒追踪分析（NTA）是标准技术，可调电阻脉冲感应（TRPS）对多分散样品分辨率更高，透射电子显微镜（TEM）或冷冻电镜（Cryo-EM）用于观察特征性杯状形态和确认结构完整性。表面标志物方面，Western blotting和流式细胞术验证EV富集蛋白：根据MISEV指南，应包括至少三种阳性蛋白标志物（如四跨膜蛋白CD9、CD63、CD81，以及胞质蛋白TSG101和Alix）和阴性标志物（如内质网蛋白Calnexin）以排除细胞污染。先进技术如单EV流式细胞术和空间EV测序（如Spatial-EVs-seq）正成为高维表型分析和组织内EV异质性图谱的强大工具。

3.2.4. 纯度、蛋白污染和功能效力测定

EV制备中纯度评估的关键指标是颗粒-蛋白比（PPR），低PPR表示共分离的蛋白污染物（如白蛋白和脂蛋白）可能混淆治疗剂量并引发不良免疫反应。BCA或Bradford法量化总蛋白，需与颗粒计数相关。物理表征不足以预测临床疗效，必须定制针对治疗机制的功能效力测定。标准效力测定包括：增殖和迁移测定（评估EV加速成纤维细胞或角质形成细胞划痕闭合的能力）、血管生成测定（评估EV促进内皮细胞（如HUVEC）在Matrigel上管形成的能力）、免疫调节测定（通过流式细胞术测量巨噬细胞极化（如M1向M2转变）或评估LPS刺激细胞中促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的抑制）。开发标准化、稳健的效力测定是当前研究热点，对监管批准和批次一致性至关重要。

4. 细胞外囊泡（EVs）的原位递送系统

建立伤口保护屏障对伤口愈合至关重要。有效的EV递送系统需满足：高靶向能力、持续释放能力、生物相容性和可降解性。传统给药方法（如静脉注射）存在剂量调节不精确、体内EV存活率降低和脱靶风险高等缺点。局部药物递送系统（LDDSs）提供了更有效和安全的选择。水凝胶因组织再生应用被广泛研究，微针贴片等生物材料也被采用。文献计量分析显示，过去五年该领域约208篇出版物，中国研究人员贡献116篇，主要期刊包括Journal of Nanobiotechnology、Chemical Engineering Journal等。

4.1. 用于细胞外囊泡递送的水凝胶复合材料

水凝胶是稳定的亲水网络结构，具有良好的可降解性、保水性和生物相容性，其溶胀特性为伤口愈合创造湿润环境，多孔结构促进吸收渗出物和氧气渗透。

4.1.1. 传统水凝胶

EVs与水凝胶结合在组织再生和血管生成研究中显示出良好疗效。天然材料如透明质酸（HA）水凝胶用于递送细胞来源的外泌体，实现持续和控释以改善生物利用度。Liu等人设计两种HA衍生物，通过席夫碱反应原位形成水凝胶，具有广谱抗菌效果，M2外泌体释放曲线显示在21天内持续释放。Xiong等人开发可注射水凝胶，添加MnO₂/ε-PL纳米片将伤口中过量H₂O₂转化为O₂。海藻酸盐（Alg）水凝胶因高生物相容性、低成本和温和条件下与二价阳离子凝胶化而被用于封装EVs。Shafei等人表征了负载外泌体的Alg水凝胶，显示可生物降解和生物相容，EXO在前72小时累积释放超过50%，持续释放至172小时，缩短大鼠皮肤伤口愈合时间并减少瘢痕形成。壳聚糖是天然阳离子生物聚合物，具有抗菌性能，但水溶性差。Peng等人通过接枝二氢咖啡酸解决水溶性，并利用席夫碱键增强水凝胶强度和自愈能力，CS-DA/PF/TA/3D-Exo水凝胶可缓释3D-Exo。Geng等人报道了负载骨髓间充质干细胞来源外泌体（MSC-Exo）的羧乙基壳聚糖（CEC）-二醛羧甲基纤维素（DCMC）水凝胶，协同调节创伤炎症微环境并促进血管新生。Qin等人将氧化葡聚糖与羟丁基壳聚糖结合作为BMSC来源外泌体载体，与传统壳聚糖水凝胶相比，在14和16小时减少外泌体泄漏30.4%和42.4%。传统水凝胶缺乏刺激响应功能，但仍通过延长释放、维持有效局部药物浓度和减少给药频率发挥重要作用。

4.1.2. 刺激响应水凝胶

为克服传统水凝胶局限性，研究者开发了多种刺激响应水凝胶，实现对EV释放的精确控制。

温敏水凝胶：Pluronic F-127（PF-127）是FDA批准的生物相容性三嵌段共聚物，具有可逆热凝胶行为：低温（4℃）为自由流动溶液，升温至生理温度（37℃）形成物理交联可注射水凝胶，实现微创原位递送和持续滞留。Yang等人开发PF-127与hUCMSC-exos的复合水凝胶，凝胶化温度可通过PF-127浓度调节，20% (w/v)制剂在17.8℃开始凝胶化，28% (w/v)在12.4℃凝胶化。FEP@exos在30℃发生溶胶-凝胶转变，持续释放EVs并保持生物活性，促进内皮细胞增殖、迁移和管形成。Liu等人制备ABA型两亲性温敏水凝胶，储存模量（G'）在25℃显著增加，荧光显示外泌体在48小时达到峰值，72小时仍可测，可用于持续药物递送。

光敏水凝胶：甲基丙烯酸明胶（GelMA）是明胶衍生物，通过紫外或可见光在光引发剂存在下交联，具有可调节机械性能和延长EV保留能力。Hu等人开发缺氧预处理的ADSC-Exo嵌入GelMA水凝胶，光照后快速凝胶化，递送circ-Snhg11通过miR-144-3p/NFE2L2/HIF1α信号通路增强内皮细胞存活和迁移。为维持EV生物活性，引入生物素修饰GelMA（BioGelMA），405 nm UV光照射15秒实现溶胶-凝胶转变。GelMA还用于递送EV模拟物，首次应用于皮肤伤口愈合，解决EV产量低的问题。

pH响应水凝胶：Wang等人开发可注射温敏和pH响应FHE水凝胶（PF-127、氧化透明质酸（OHA）和EPL），通过席夫碱键形成，EVs在弱酸性环境中因席夫碱键断裂而释放，适用于急性伤口酸性微环境。

多刺激响应水凝胶：Wang等人报道可注射黏附温敏多功能多糖敷料（FEP），具有持续pH响应EV释放。Li等人开发双敏感水凝胶，在35℃和pH 6.5时溶解率最高。α-硫辛酸（LA）被引入壳聚糖骨架，开发光交联壳聚糖水凝胶，具有H₂O₂、葡萄糖和pH响应释放能力。

导电水凝胶：伤口部位天然存在内源性电场，导电水凝胶需具备与人体皮肤生理范围匹配的电导率（10^-4至10^-2 S/cm）。Zhang等人将多壁碳纳米管纳入水凝胶，为EVs和二甲双胍提供稳定三维结构，导电性促进细胞电活性和信号传导，加速伤口愈合。

4.1.3. 水凝胶-EV复合材料的关键材料性质与释放动力学

EV负载水凝胶的治疗功效受水凝胶基质理化性质高度影响，需精确设计以动态适应伤口微环境。关键参数包括交联化学、凝胶化动力学、机械模量、降解行为以及EV保留和释放曲线。交联方面，物理交联（热凝胶、离子相互作用、主客体识别）或化学交联（光交联、席夫碱反应、酶交联）用于原位递送，理想凝胶化时间从数秒到数分钟。机械模量应模仿天然皮肤ECM，G'通常在100 Pa至10 kPa之间。湿组织黏附性通过儿茶酚基团（如多巴胺修饰的HA或明胶）或动态共价键（如动态席夫碱键）实现。降解曲线需与伤口愈合时间线同步（急性伤口1–3周，慢性更长），主要通过水解或酶降解（如明胶酶降解明胶）。释放动力学通常由扩散和基质降解共同控制，初始爆发释放后持续释放，保留效率高度依赖交联密度和聚合物浓度。

4.2. 其他递送系统

微针贴片（MNPs）是EV靶向给药的重要新方法。水凝胶MNPs因生物相容性、微创性、延长药物保留时间和高装载效率而被使用。研究者利用微模塑技术制备含GelMA和聚乙二醇二丙烯酸酯的MNPs，用于控制释放内皮来源外泌体，在糖尿病小鼠中促进血管生成和上皮化。Zeng等人将M2巨噬细胞来源EVs封装在针尖，聚多巴胺（PDA）纳米颗粒在背衬层，同时抑制炎症和改善血管生成。聚乙烯醇（PVA）因丰富羟基可形成物理或化学交联网络。Zhang等人提出可调节驻留水凝胶微针，利用霍夫迈斯特效应使刚度可调，确保皮肤穿透和外泌体释放。

4.3. 细胞外囊泡递送平台的讨论与转化视角

EV伤口疗法的临床转化依赖于选择与目标伤口病理特征匹配的最佳递送平台。传统水凝胶（如HA、海藻酸盐、壳聚糖）具有优异生物相容性、成本效益和简单制造，维持湿润环境并吸收渗出物，适用于轻度至中度急性伤口，但缺乏精确时空控制，易在高度蛋白水解的慢性伤口中快速降解。刺激响应水凝胶实现“按需”或微环境触发释放，pH响应系统特别适用于酸性慢性糖尿病伤口，光敏水凝胶（如GelMA）提供快速原位凝胶化，但制造复杂、光引发剂可能具有细胞毒性，可扩展性和重现性仍是瓶颈。MNPs通过微创经皮递送直接进入更深表皮或真皮，适用于靶向治疗（如瘢痕减少或浅表慢性溃疡），但每贴片EV装载量低，不适合高渗出或严重感染伤口。未来临床实施可能需要组合策略，如整合传统水凝胶的屏障功能与MNPs的精确靶向能力，或工程化多刺激响应系统同时解决感染、氧化应激和EV释放。

5. 结论与展望

本综述强调基于EV的疗法，特别是与LDDSs整合时，作为有前景的下一代伤口愈合工具。通过系统总结各愈合阶段的分子机制并评估从传统水凝胶到先进刺激响应系统及微针贴片的各种递送平台的设计原理，突出了LDDSs如何通过最大化局部生物利用度、保持生物活性和提供组织再生结构引导来赋能EVs。尽管临床前成功显著，但EV-LDDS混合体的临床转化面临几个严峻挑战：(i) 可扩展制造和质量标准化：EV生产低效且难以规模化，需优化3D培养系统、中空纤维生物反应器和可扩展分离技术（如切向流过滤），并建立统一的表征指南（如MISEV）。(ii) 体内命运、稳定性和药代动力学：LDDSs改善局部保留，但EV从这些生物材料释放后的精确体内生物分布、降解途径和半衰期了解不足，需先进体内追踪技术和药代动力学/药效学分析。(iii) 监管途径和临床试验设计：EV-LDDS混合体是复杂组合产品，需与监管机构合作制定针对这些混合系统的安全性、有效性和质量评估标准。展望未来，LDDSs应从被动或单刺激响应载体发展为能实时监测伤口微环境的智能系统，并与其他治疗方式（如生长因子、抗菌肽、CRISPR/Cas9或产氧纳米材料）联合使用，以及利用患者特异性或伤口特异性EV配方，实现个性化精准再生治疗。