《Journal of Functional Biomaterials》：Drug Nanocrystal-Loaded Thermo-Reversible Hydrogels of Dexamethasone Palmitate for Intratympanic Drug Delivery
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鼓室内（intratympanic, IT）注射皮质类固醇是感音神经性听力损失的标准临床治疗方法；然而，同时实现良好生物相容性与高效耳蜗药物递送仍然是一项重大挑战。本文构建了一种新型棕榈酸地塞米松-21（dexamethasone-21-palmitate,
鼓室内（intratympanic, IT）注射皮质类固醇是感音神经性听力损失的标准临床治疗方法；然而，同时实现良好生物相容性与高效耳蜗药物递送仍然是一项重大挑战。本文构建了一种新型棕榈酸地塞米松-21（dexamethasone-21-palmitate, DEX-P）药物纳米晶（nanocrystal, NS）负载热可逆水凝胶（thermo-reversible hydrogel, TG）系统（NS-TG），以改善其IT递送。DEX-P是地塞米松（dexamethasone, DEX）的一种亲脂性前药。研究人员采用以聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）为稳定剂的双离心（dual centrifugation, DC）工艺，制备了平均粒径为835.0 nm的NS。由19%（w/v）Poloxamer 407水凝胶中分散NS构成的NS-TG系统表现出快速胶凝（2–3 min），并通过胶束增溶作用使药物溶解度较单独NS提高31倍，达到1.57 ± 0.02 mg/mL。在HEI-OC1细胞中的体外细胞毒性实验表明，NS-TG具有很高的生物相容性并可维持细胞活力，而商品化脂质乳剂（Lipothason?）则诱导了显著细胞毒性。小鼠体内药代动力学评价显示，IT给药的NS-TG较DEX-SP溶液和DEX-P NS具有更优的耳蜗药物吸收，尽管其吸收仍低于脂质乳剂。这些结果提示，DEX-P NS-TG系统在进一步研究后有望成为耳蜗类固醇递送的潜在平台，在治疗内耳疾病时提供递送效率与局部安全性之间的最佳平衡。
该文发表于《Journal of Functional Biomaterials》，围绕感音神经性听力损失的局部药物治疗难题，提出了一种兼顾递送效率与耳部安全性的鼓室内给药新策略。感音神经性听力损失是一类与耳蜗感觉毛细胞或听神经纤维进行性退变相关的重要听觉疾病，炎症、噪声过度刺激及耳毒性药物暴露均可诱发该病。尽管全身应用糖皮质激素仍为临床常规方案，但血-迷路屏障（blood–labyrinth barrier, BLB）显著限制药物进入内耳，导致需使用更高全身剂量，进而增加脱靶不良反应风险。相较之下，鼓室内（intratympanic, IT）注射可依赖圆窗膜（round window membrane, RWM）这一通道将药物局部送达耳蜗外淋巴，减少系统暴露，因此成为更具优势的局部给药路径。
然而，现有IT治疗仍存在两个核心瓶颈。其一，临床常用的地塞米松磷酸钠（dexamethasone sodium phosphate, DEX-SP）虽具良好水溶性，但在中耳腔内易经咽鼓管迅速清除，驻留时间短；其二，DEX-SP本身亲水性强，被脂质性RWM被动转运的能力有限。为提升RWM通透性，研究逐渐转向更具亲脂性的前药，如棕榈酸地塞米松-21（DEX-P）。DEX-P具有很高的辛醇/水分配系数，更易与RWM脂双层相互作用，理论上更有利于跨膜递送。但DEX-P极强的疏水性使其通常依赖脂质乳剂或脂质体增溶。现有商业化脂质乳剂虽然能够实现有效递送，却需高浓度大豆油和卵磷脂维持药物溶解与稳定，这在中耳和内耳这一精细微环境中可能带来黏膜刺激、炎症反应、离子稳态紊乱乃至耳毒性风险。因此，开发一种低辅料负荷、兼具高递送能力和良好局部耐受性的DEX-P递送系统具有明确必要性。
研究人员据此构建了DEX-P药物纳米晶（NS）负载热可逆水凝胶（NS-TG）平台。其基本思路是：首先利用纳米晶技术增大药物比表面积、提高表观溶解度和溶出速率；再将其嵌入温敏性Poloxamer 407（P407）水凝胶中，使制剂在室温下保持低黏度便于注射，在生理温度下迅速原位成胶，形成中耳局部药物储库，从而延长驻留时间并促进持续向耳蜗递送。结果表明，该系统能够在保持良好生物相容性的同时改善耳蜗药物暴露，尤其相对于DEX-SP溶液和普通纳米晶制剂展现出更优的体内吸收特征，提示其在内耳疾病局部类固醇治疗中具有重要应用价值。
本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员以双离心（DC）珠磨法制备DEX-P纳米晶，并筛选稳定剂及工艺参数；以不同浓度P407构建温敏水凝胶，通过流变学评估溶胶-凝胶转变；采用扫描电子显微镜（SEM）、动态光散射（DLS）、Zeta电位、X射线衍射（XRD）和差示扫描量热（DSC）表征理化性质；通过体外溶出实验、酯酶转化实验及HEI-OC1小鼠听觉细胞毒性实验评价功能与安全性；动物实验使用8周龄雄性C57BL/6小鼠，结合听性脑干反应（ABR）与耳蜗组织液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测完成体内生物相容性和药代动力学分析。
3.1. Design of DEX-P NSs Using Bead-Milling Technique
本节围绕DEX-P纳米晶的制备工艺优化展开。研究人员指出，此前DEX-P内耳递送主要依赖脂质增溶系统，而本研究首次将固态纳米晶策略应用于这一亲脂性皮质类固醇前药。研究通过双离心珠磨技术，以氧化锆微珠为研磨介质，在等渗葡萄糖-磷酸盐缓冲体系中制备纳米晶。不同表面活性剂和亲水聚合物筛选结果显示，多数稳定剂无法有效抑制颗粒聚集，制得粒径往往大于5 μm；相比之下，羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮K30及PVA能够形成较稳定的亚微米晶体，其中PVA表现最佳。研究进一步证实，随着PVA浓度升高，粒径和多分散指数（PDI）降低，说明更充分的表面覆盖可改善空间位阻稳定作用。与此同时，研磨强度升高虽可将粒径降至约200–300 nm，但会因高亲脂性药物吸附于氧化锆珠表面而造成显著药物损失。综合粒径控制与药物回收率，研究最终确定了4 mg/mL或8 mg/mL药物负载、PVA 0.5%或1.0%、1500 rpm研磨的优化条件，获得平均粒径约1000 nm且可重复制备的DEX-P NS。
3.2. Design of DEX-P NS-TGs with P407
本节聚焦温敏凝胶系统的构建与筛选。研究人员将DEX-P NS进一步分散于P407中，构建热可逆原位凝胶系统，以期延长中耳腔内驻留并促进持续释放。倒置试验显示，含16%–19%（w/v）P407的制剂在25 °C均维持流动性液态，有利于经细针完成IT注射；但在37 °C时，仅≥18% P407的体系可在2–3 min内转变为稳定半固体凝胶。流变学分析进一步证实，未加P407的NS体系在整个温度区间均表现为G″高于G′的黏性液体行为，而18%和19% P407体系出现明显模量上升，尤其4 NS–19%TG在20–25 °C区间即表现出显著溶胶-凝胶转变，提示其在体内可迅速成胶。复数黏度（η*）分析表明，19% P407体系在25 °C和37 °C下均具有更高流变阻力和更强网络结构。基于成胶迅速、机械强度高及潜在抗咽鼓管引流能力更强等特点，研究选择4 NS–19%TG进入后续研究。
3.3. Physicochemical Characteristics of DEX-P NS and NS-TG
本节系统表征优化后制剂的理化性质。扫描电子显微镜结果显示，原始DEX-P为大于20 μm的不规则块状颗粒，而4 NS、8 NS及4 NS–19%TG中药物均转变为分散良好的纳米晶。动态光散射结果表明，4 NS和8 NS平均水动力学粒径分别为835.0 ± 9.5 nm和946.3 ± 10.9 nm，PDI均低于0.3；引入P407后，4 NS–19%TG粒径略增至1176.0 ± 11.0 nm，推测与聚合物链吸附于晶体表面有关。各制剂Zeta电位介于?4.4至?11.6 mV之间，呈近中性至轻度负电性。药物含量均接近理论值，提示制备过程中未发生明显降解。尤为关键的是，P407显著改变了药物在悬浮态与溶解态之间的分配：4 NS和8 NS中溶解DEX-P仅为0.05–0.08 mg/mL，而4 NS–19%TG中增至1.57 ± 0.02 mg/mL，为前者约31倍，表明高浓度P407通过胶束增溶显著提升表观溶解度，同时仍保留2.32 ± 0.08 mg/mL纳米悬浮储库。XRD和DSC结果共同表明，经珠磨及成胶处理后DEX-P晶型基本保持，未见明显无定形化或多晶型转变。所有制剂pH和渗透压均处于生理适宜范围，支持其IT给药相容性。
3.4. In Vitro Dissolution Profile of DEX-P NS and NS-TG
本节比较原料药、纳米晶和凝胶纳米晶的体外溶出行为。研究在模拟内耳环境的人工外淋巴液中，于增溶剂存在下建立漏槽条件。结果显示，原料DEX-P在48 h内累计释放不足15%，反映其固有疏水性导致的极差溶出。相比之下，4 NS与8 NS在前48 h内均可达到约80%的累计释放，说明纳米化显著提高药物溶出速率，这与粒径减小后比表面积增加、润湿性改善及晶格能降低相关。4 NS–19%TG则呈现双相释放特征：初期24 h释放更快，累计释放超过65%，主要源于体系中预先被P407胶束增溶的较高溶解态药物比例；之后释放速率减慢，提示水凝胶三维网络对残余纳米晶溶解和扩散产生屏障作用。因此，NS-TG兼具快速起效和后续延长暴露的特征。
3.5. In Vitro Enzymatic Conversion of DEX-P to DEX
本节考察DEX-P向活性药DEX的酶促转化。研究人员在有无酯酶条件下监测DEX-P水解，结果表明，在PBS中96 h内几乎未检测到DEX生成，说明其酯键在生理缓冲液中具有较高化学稳定性；加入酯酶后，DEX生成随时间逐渐增加，24 h、48 h和96 h时转化率分别约为36.8 ± 6.4%、68.2 ± 7.6%和99.8 ± 11.2%。这表明DEX-P在缺乏酶环境中可维持前药状态，而在富酶环境中则可被持续激活。结合文中讨论，该特征意味着DEX-P在中耳腔中可较稳定存在并以亲脂性前药形式穿越RWM，而进入耳蜗组织后再被局部酯酶逐步转化为DEX，从而支持空间上更有针对性的药物活化机制。
3.6. In Vitro Cytotoxicity and In Vivo Biocompatibility Assessments
本节从细胞与动物层面评价制剂安全性。HEI-OC1细胞活力实验显示，商品化脂质乳剂处理后细胞相对存活率下降至约70%，而4 NS、8 NS和4 NS–19%TG均维持在95%以上，无显著毒性。PI流式细胞术结果与此一致：脂质乳剂组PI阳性细胞显著升高，而纳米晶及纳米晶凝胶组接近未处理对照。研究据此认为，纳米晶体系使用的PVA和P407安全性良好，且其“溶出受限”暴露模式避免了脂质乳剂可能导致的急剧细胞内暴露峰值。体内方面，研究通过ABR检测小鼠IT给药后1周和2周听阈变化。1周时各组无显著差异；2周时脂质乳剂组听阈显著高于对照组，而8 NS和4 NS–19%TG与对照组相当，提示纳米晶体系未引起可测量耳毒性。术后肉眼观察鼓膜、中耳腔及耳蜗亦未见明显水肿、出血、炎性渗出等异常，进一步支持该系统具有较好的局部耐受性。
3.7. Storage Stability of Lyophilized DEX-P NS and NS-TG
本节评估制剂冻干后的短期稳定性。研究将DEX-P NS和NS-TG经标准化冻干处理后，于25 °C/60%相对湿度条件下保存4周。结果显示，两类制剂冻干块外观完整，无塌陷或明显吸湿收缩；复溶后可形成均一悬液。4 NS–19%TG复溶后粒径与Zeta电位与初始值相比无明显变化，PDI仍维持在较窄范围，说明PVA和葡萄糖共冻干有助于抑制纳米晶在冻融及储存过程中的不可逆聚集与熟化。药物含量均保持在96%以上，提示短期内未见明显水解或氧化降解。该结果支持该平台在固态保存方面具备良好潜力，但文中同时指出仍需后续长期和加速稳定性验证。
3.8. In Vivo Cochlear Drug Remaining Following IT Injection
本节为全文核心应用结果，比较不同制剂IT给药后耳蜗中DEX暴露水平。研究以DEX-SP溶液、脂质乳剂（LE）、4 NS、8 NS和4 NS–19%TG为比较对象，测定耳蜗匀浆中DEX浓度。DEX-SP在1 h达到快速峰值，但6 h即接近基线，呈现典型“快速暴露-快速清除”特征。LE则表现出更高且更持久的耳蜗暴露，3 h和6 h时药物浓度显著高于DEX-SP，AUClast约为其2.3倍，说明脂质增溶和增强膜通透效应仍然带来最强吸收。4 NS与8 NS虽然体外溶出较快，但体内耳蜗暴露均较低，提示在内耳有限液体环境中，缺乏漏槽条件会限制晶体溶解并削弱跨RWM扩散驱动力。相比之下，4 NS–19%TG在所有时间点均优于普通NS：其1 h耳蜗药物水平为16.1 ± 6.1 ng/mg，与LE相近，显著高于4 NS和8 NS；3 h和6 h虽低于LE，但仍显著高于单纯NS。药代参数显示，4 NS–19%TG的C
max为16.2 ± 5.9 ng/mg，分别约为4 NS和8 NS的2.4倍和1.6倍，同时达到LE的约64%；AUClast高于DEX-SP、4 NS和8 NS，但约为LE的60%。至24 h时，4 NS–19%TG和LE组耳蜗药物浓度均下降至约1.0 ng/mg，48 h时低于检测限。这说明P407凝胶虽能形成局部储库并改善初期和中期递送，但在啮齿动物中耳动态环境下仍会逐渐侵蚀和清除，持续时间尚有限。
综合全文，研究人员通过药物纳米晶化与温敏水凝胶技术整合，成功构建了一种DEX-P NS–TG局部递送平台。该系统在理化层面实现了稳定纳米晶制备、显著胶束增溶和适宜的原位凝胶特性；在生物学层面体现出优于商业脂质乳剂的细胞与听功能安全性；在药代层面则较DEX-SP溶液和普通纳米晶显著提高耳蜗药物暴露。论文讨论指出，尽管其吸收尚未超过LE，但其在递送效率与局部安全性之间展现出更优平衡，因此具有作为内耳局部类固醇治疗平台的潜力。文中同时强调，后续仍需在疾病模型中验证疗效，进一步解析DEX-P与DEX在圆窗膜转运及耳蜗内生物转化过程中的动态关系，并开展重复给药毒性及长期稳定性研究。
研究结论部分可译为：本研究成功构建了一种用于IT类固醇治疗的先进且具有良好生物相容性的DEX-P纳米递送平台，该平台通过将药物纳米晶化与温度响应性水凝胶技术相结合而实现。采用基于DC的珠磨工艺制备的DEX-P纳米晶被稳定整合至19%（w/v）P407基质中。该杂化系统不仅通过胶束增溶显著提高了药物表观溶解度，而且保证了给药便利性，并可在生理温度下快速原位成胶。该新型系统有效减轻了商业化脂质乳剂在HEI-OC1细胞中常见的急性细胞毒性。此外，小鼠体内药代动力学评价表明，IT给药4 NS–19%TG可实现与脂质乳剂相当的初始耳蜗药物吸收水平，且显著高于DEX-SP溶液和NS。总体而言，这些结果表明DEX-P NS–TG系统是一种安全、稳健的局部治疗平台，适用于感音神经性听力损失及其他内耳疾病的治疗。未来研究将进一步通过粒径调控优化溶出动力学，并通过增强机械韧性和黏膜黏附性延长NS–TG的驻留时间。
