用于晚期前列腺癌PSCA靶向Adapter Molecules的新型RevCAR-T细胞治疗

《International Journal of Molecular Sciences》：Novel PSCA-Targeting Adapter Molecules for Late-Stage RevCAR-T Cell Therapy in Prostate Cancer

　　

嵌合抗原受体（CAR）疗法正成为极具前景的策略，尤其针对转移性去势抵抗性前列腺癌（PCa），因为其作用不依赖于雄激素受体轴。诸如RevCAR系统等Adapter CAR-T细胞平台，能够通过小分子量、快速消除的肿瘤特异性adapters提供精确的治疗控制与肿瘤靶向。为了在PCa患者中实现更便捷的晚期RevCAR-T治疗，允许进行非连续性的反向靶点模块给药，研究人员开发了新型、分子量更大的基于IgG4的靶向前列腺干细胞抗原的RevTMs，并将其与先前描述的较小adapter分子形式进行了基准比较。在RevCAR系统内，PSCA-IgG4 RevTMs在低效靶比和低RevTM浓度下，以严格的抗原依赖性方式有效介导了PCa细胞的杀伤。其裂解活性伴随着在较宽RevTM浓度范围内快速且显著的促炎细胞因子释放，这对于免疫学冷的PCa尤为有利。最后，在短期小鼠模型中证实了其抗肿瘤活性。初步正电子发射断层扫描研究进一步表明，新型IgG4-RevTMs具有缓慢的血液消除和肿瘤特异性聚集。综合而言，这些数据表明PSCA-IgG4 RevTMs可作为PCa阶梯式RevCAR-T治疗的有希望的候选方案，在该方案中，最初使用半衰期短的scFv-RevTMs以确保快速的安全性转换，随后在明确风险特征后使用较大分子的IgG4-RevTMs。

前列腺癌（PCa）是全球男性中最常见的恶性肿瘤之一，转移性去势抵抗性前列腺癌是该疾病的晚期阶段，预后极差且缺乏治愈性治疗手段。尽管雄激素剥夺疗法和新型雄激素受体（AR）通路抑制剂在初期治疗中取得了一定进展，但绝大多数晚期患者最终会产生继发性耐药。目前，靶向前列腺特异性膜抗原或前列腺干细胞抗原（PSCA）的嵌合抗原受体（CAR）-T细胞免疫疗法展现出克服肿瘤免疫抑制微环境的潜力。然而，传统的CAR-T疗法由于存在不可控的严重免疫介导不良事件，如细胞因子释放综合征，其临床应用面临安全性瓶颈。此外，由于健康组织也有低水平的PSCA表达，非肿瘤靶向毒性也是亟待解决的难题。为了在提高疗效的同时实现精确控制，研究人员开发了基于多肽的Adapter CAR-T平台（如RevCAR系统）。该平台通过可逆转的On/Off控制机制调节T细胞活性。然而，既往基于小分子单链抗体（scFv）的Adapter Molecules由于分子量低于肾脏清除阈值，体内半衰期短且清除过快，限制了其在实体瘤中的持续暴露与治疗效能。因此，开展本研究旨在优化Adapter Molecules的药代动力学特性，开发分子量更大且半衰期更长的新型IgG4骨架PSCA Redirect Molecules，以期为晚期PCa患者提供更安全且便捷的门诊维持治疗方案。该研究成果发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

在主要技术方法方面，研究人员将人源化抗PSCA scFv（MB1）与hIgG4-Fc域及特异性抗La scFv融合，构建了新型双特异性PSCA-IgG4 RevTMs。研究采用源于健康供者外周血单核细胞并经慢病毒转导表达的RevCAR-T细胞作为效应细胞，靶细胞为强制稳定过表达PSCA和荧光素酶的AR阳性（LNCaP）和AR阴性（PC3）PCa细胞系。通过定量流式细胞术验证结合亲和力，运用荧光素酶体外杀伤实验评估在不同效靶比下的肿瘤细胞清除率，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量分析T细胞效应因子的分泌情况。在动物模型层面，使用免疫缺陷NXG小鼠建立皮下共注射异种移植瘤短期模型，利用活体生物发光成像观测肿瘤生长。同时，对放射性核素⁶⁴Cu标记的RevTMs进行微型正电子发射断层扫描以初步评估其体内生物分布情况。

E5B9-和E7B6-RevCAR系统新型PSCA-IgG4 RevTMs的设计
通过基因重组技术构建的PSCA-IgG4-5B9和PSCA-IgG4-7B6 RevTMs被表达于真核3T3细胞中，其N端带有Igκ leader，分子量约为83 kDa，在非还原生理条件下通过铰链区间的二硫键形成同源二聚体。每个RevTM表现出双特异性双价结合特征，可同时靶向PSCA和相应La表位。纯化结果显示，两种RevTMs均具备高纯度和良好的同质性。该设计有效延长了分子半衰期并减少了Fcγ受体介导的脱靶免疫激活风险。

PCa细胞系模型、E5B9-和E7B6-RevCAR T细胞的表征
为克服体外常规培养导致PSCA表达下调的问题，研究人员对LNCaP和PC3细胞进行了基因修饰以稳定过表达PSCA。定量流式细胞术表明，靶细胞的PSCA表面表达量可达近三万个分子/细胞，接近内源性表达水平。效应T细胞经慢病毒转导后，表面RevCAR的表达与共转译的EGFP标记物高度正相关。不同供体T细胞的转导效率平均在75%至79%之间，且细胞存活率保持在约87%以上，提示系统具有稳定可靠的可重复性。

新型PSCA-IgG4 RevTMs对PSCA+肿瘤和RevCAR-T细胞的高亲和力结合
RevTMs的首要功能前提是对靶抗原和效应细胞表面受体具备高亲和力。流式细胞术结果指示，PSCA-IgG4-5B9和PSCA-IgG4-7B6 RevTMs均能够特异性识别PC3肿瘤细胞以及对应的RevCAR-T细胞。在针对PC3-PSCA/PSMA Luc+细胞的结合实验中，PSCA-IgG4-7B6 RevTM表现出略优的结合动力学，KD值约为3.9 nM，而PSCA-IgG4-5B9的KD值为7.6 nM。但二者结合对应RevCAR-T细胞的亲和力相近，KD值均约为2 nM。

PSCA-IgG4 RevTMs特异性重定向RevCAR-T细胞体外高效杀伤PSCA+ PCa细胞
在体外共培养实验中，新型IgG4 RevTMs在极宽的浓度范围内均可交联RevCAR-T细胞与PSCA+肿瘤细胞，诱导显著的CD69激活上调。与传统的小分子scFv-RevTMs类似，新型IgG4 RevTMs触发T细胞释放大量TNF、IFN-γ和IL-2，并在加入Adapter后7小时内诱导高效肿瘤细胞裂解。特别重要的是，即使在不匹配的RevTMs、PSCA阴性靶细胞或仅存在单一效应/靶细胞的条件下，均未导致T细胞激活或靶细胞杀伤，证明了其细胞毒性作用具备严格的靶抗原依赖性。此外，在低至1:1的效靶比及低浓度Adapter下，RevCAR-T细胞依然能够裂解AR阳性和AR阴性的PSCA+ PCa细胞系，其杀伤效率和剂量响应曲线与传统scFv形式Adapter接近，半数最大有效浓度（EC₅₀）均在皮摩尔浓度级别。研究还发现，T细胞杀伤活性与细胞因子释放的敏感阈值存在显著分离现象。细胞因子分泌达到峰值所需的RevTM浓度显著高于触发肿瘤细胞杀伤所需浓度。这意味着低剂量给药可在保证有效清除肿瘤细胞的同时，显著限制系统性细胞因子的过度释放，从而改善治疗安全性。

PSCA-IgG4 RevCAR系统在短期PCa异种移植小鼠模型中的有效性
为评估体内抗肿瘤效力，免疫缺陷NXG小鼠皮下被同时接种PC3-PSCA/PSMA Luc+肿瘤细胞和RevCAR-T细胞。加入PSCA-IgG4-5B9或PSCA-IgG4-7B6 RevTMs的治疗组小鼠在数天内肿瘤活体生物发光信号迅速且显著降低。与体外实验一致，两种RevCAR系统在体内展现出相当的抗肿瘤效能，而未添加RevTMs的对照组肿瘤进展未受抑制。

新型PSCA-IgG4 RevTMs的生物分布与小动物PET概念验证研究
初步的PET成像分析为新型RevTMs的药代动力学提供了体内概念验证。在经过NODAGA修饰并用⁶⁴Cu放射性核素标记后，两种RevTMs均表现出在血液池中缓慢消除的特征，且在移植瘤部位呈现出明显的特异性聚集。这种滞留和积累趋势证实了IgG4骨架改造带来的药代动力学改善。除经由肝脏代谢的迹象外，骨髓及其他器官未见显著非特异性高积累，提示了该大型分子在保障瘤内持续治疗浓度的前提下，并未增加明显的脱靶聚集风险。

综上所述，研究讨论部分指出，鉴于在实体瘤治疗中传统小型Adapter分子因快速清除而限制疗效，新型IgG4-RevTMs通过增大分子尺寸逃避了肾脏快速滤过，从而延长了体内循环时间并实现了肿瘤组织内的有效富集。这不仅有望深化实体瘤的持续抗肿瘤效应，还提供了实施阶梯式治疗策略的重要基础：在风险未知的治疗初期，仍首选半衰期短的scFv-RevTMs以实现快速安全切换与毒性管理；当进入风险较低且需维持长期药效的巩固治疗期，则可转换为大分子IgG4-RevTMs进行非连续性给药，以此优化患者生活品质并降低长期住院负荷。具有良好药代动力学特性的PSCA-IgG4 RevTMs还可进一步拓展为结合诊断与靶向放射性免疫治疗的多功能分子，在晚期前列腺癌中实现更有效的协同杀伤。主要研究结论可总结为：新型IgG4骨架改造的Adapter Molecules不仅可高效介导RevCAR-T细胞对PSCA阳性前列腺癌的体外和体内靶向杀伤，通过独特的药代动力学优化提升了血的半衰期并增强了肿瘤靶向聚集，同时在保证严格抗原依赖的靶向安全机制外，为临床转化中的阶梯式门诊维持治疗模式提供了切实可行的药理学基础和理论依据。