黄芩素通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路减轻高糖和棕榈酸钠诱导的心肌细胞铁死亡

《International Journal of Molecular Sciences》：Baicalein Attenuates High Glucose and Sodium Palmitate-Induced Ferroptosis in Cardiomyocytes via the Nrf2/SLC7A11/GPX4 Signaling Pathway

　　

糖尿病（DM）在全球范围内迅速增加，糖尿病心肌病（DCM）已成为糖尿病患者的主要死亡原因。因此，迫切需要有效的DCM预防和治疗策略。铁死亡是一种受调控的细胞死亡形式，已被认为参与DCM的发病机制。本研究整合了网络药理学、数据挖掘、分子对接、分子动力学模拟和体外实验，以探讨黄芩素是否抑制高糖和棕榈酸钠（HG+PA）诱导的心肌细胞铁死亡，并阐明其潜在机制。黄芩素显著改善了H9c2和AC16细胞的活力，减少了细胞死亡，并降低了HG+PA条件下的LDH释放。网络药理学预测，黄芩素对HG+PA诱导的心肌细胞损伤的保护作用与铁死亡调控相关。转录组数据挖掘进一步在互补的体外和糖尿病大鼠心脏数据集中鉴定出铁死亡相关通路富集。分子对接预测了黄芩素与Nrf2、SLC7A11和GPX4的有利结合构象，而分子动力学模拟表明所模拟的复合物总体稳定。体外实验进一步证实了铁死亡的参与，因为铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）逆转了HG+PA诱导的细胞活力下降。相反，铁死亡诱导剂Erastin降低了细胞存活率并拮抗了黄芩素所提供的保护，表明黄芩素通过抑制铁死亡发挥作用。黄芩素降低了脂质过氧化、MDA和Fe²⁺水平以及ACSL4和PTGS2的mRNA表达，同时恢复了GSH/GSSG比值以及Nrf2、SLC7A11和GPX4的蛋白表达。这些保护作用被Nrf2抑制剂ML385部分逆转。总之，黄芩素通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路并抑制铁死亡，保护心肌细胞免受HG+PA诱导的损伤。

**论文解读**

**研究背景与问题**
糖尿病（DM）在全球范围内发病率持续攀升，其心血管并发症是患者死亡的主要原因。糖尿病心肌病（DCM）作为糖尿病特异性心肌结构和功能异常，早期常无症状，但可逐渐进展为心力衰竭甚至猝死。目前DCM的治疗主要依赖血糖控制和症状缓解，缺乏直接针对糖尿病心肌损伤的靶向治疗策略。铁死亡作为一种铁依赖的、以脂质过氧化为特征的调节性细胞死亡形式，已被报道参与DCM的发病机制。在糖尿病代谢应激下，高糖和棕榈酸钠（HG+PA）可促进活性氧生成、细胞内铁蓄积、谷胱甘肽耗竭及GPX4功能障碍，从而驱动心肌细胞铁死亡。黄芩素是从黄芩根中提取的天然黄酮类化合物，已被鉴定为天然铁死亡抑制剂，并具有抗氧化、抗炎和心脏保护作用。然而，黄芩素是否通过抑制铁死亡来保护心肌细胞免受HG+PA诱导的糖脂毒性损伤，以及其具体分子机制尚不明确。

**研究内容与结论**
本研究通过整合网络药理学、转录组数据挖掘、分子对接、分子动力学模拟及体外实验，系统探究了黄芩素对HG+PA诱导的心肌细胞铁死亡的保护作用及机制。研究首先在H9c2和AC16心肌细胞中建立了HG+PA损伤模型，发现黄芩素显著提高细胞活力、减少细胞死亡和LDH释放。网络药理学预测黄芩素对DCM的保护作用与铁死亡调控相关，进一步转录组数据挖掘（GSE21023和GSE4745）证实铁死亡通路在体外和糖尿病大鼠心脏数据集中富集。分子对接和分子动力学模拟显示黄芩素与Nrf2、SLC7A11和GPX4存在稳定结合。体外实验利用铁死亡抑制剂Fer-1可逆转HG+PA诱导的细胞活力下降，而铁死亡诱导剂Erastin则削弱黄芩素的保护作用，证实铁死亡参与其中。黄芩素可降低脂质过氧化、MDA和Fe²⁺水平，下调促铁死亡基因ACSL4和PTGS2的mRNA表达，同时恢复GSH/GSSG比值及Nrf2、SLC7A11和GPX4的蛋白表达。Nrf2抑制剂ML385可部分逆转上述保护效应，表明Nrf2/SLC7A11/GPX4通路是黄芩素抑制铁死亡的关键机制。该研究证实黄芩素通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡，从而保护心肌细胞。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键技术方法**
1. **网络药理学**：整合BATMAN-TCM、SwissTargetPrediction、SuperPred、SEA、PharmMapper等数据库预测黄芩素靶点，结合OMIM、GeneCards、CTD数据库获取DCM相关基因，通过STRING和Cytoscape构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并进行KEGG富集分析。
2. **转录组数据挖掘**：使用GSE21023（体外AC16细胞）和GSE4745（糖尿病大鼠心脏）两个公开数据集，鉴定差异表达基因（DEGs）并进行KEGG通路富集，与网络药理学结果交叉分析。
3. **分子对接与分子动力学模拟**：利用AutoDock Vina进行分子对接预测黄芩素与Nrf2（AlphaFold AF-Q16236-F1）、SLC7A11（PDB ID 7P9U）和GPX4（PDB ID 6ELW）的结合模式；采用GROMACS在CHARMM36力场下进行100纳秒分子动力学模拟，分析RMSD、RMSF、SASA、氢键及自由能景观。
4. **体外细胞实验**：使用AC16（人）和H9c2（大鼠）心肌细胞系，采用CCK-8法检测细胞活力，Calcein-AM/PI染色评估活死细胞，LDH释放实验检测细胞膜损伤，铁死亡抑制剂Fer-1和诱导剂Erastin进行药理学干预，Nrf2抑制剂ML385验证通路依赖性。生化指标包括MDA、GSH/GSSG、细胞内Fe²⁺（FerroOrange探针）、脂质过氧化（C11-BODIPY 581/591）、Western blot检测Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达，RT-qPCR检测ACSL4和PTGS2 mRNA表达。

**研究结果**
**2.1 建立HG+PA诱导的心肌细胞损伤模型及优化黄芩素处理浓度**：在AC16和H9c2细胞中，HG条件下PA呈浓度依赖性降低细胞活力，分别计算IC₅₀值（AC16: 406.3 μM；H9c2: 228 μM），据此确定建模条件（AC16: 45 mM葡萄糖+400 μM PA；H9c2: 33 mM葡萄糖+250 μM PA）。黄芩素以浓度依赖方式恢复细胞活力，选用10 μM（AC16）和100 μM（H9c2）用于后续实验。
**2.2 黄芩素减轻HG+PA诱导的AC16和H9c2细胞毒性**：Calcein-AM/PI染色显示HG+PA显著增加PI阳性细胞（死细胞），黄芩素减少PI阳性比例；LDH释放实验证实HG+PA升高LDH水平，黄芩素显著降低LDH释放，表明黄芩素减轻细胞死亡和膜损伤。
**2.3 网络药理学与数据挖掘鉴定铁死亡调控是黄芩素介导保护的关键机制**：筛选出305个黄芩素-DCM交集靶点，构建核心PPI网络（55个节点，2430条边）。KEGG富集与转录组数据集（GSE21023、GSE4745）的DEGs富集结果交叉，识别出6个共享通路，包括铁死亡。
**2.4 药理学和计算机分析提示Nrf2–SLC7A11–GPX4轴参与黄芩素介导的HG+PA诱导铁死亡保护**：Fer-1（3 μM）提高HG+PA处理下AC16细胞活力，Erastin（2 μM）削弱黄芩素对活力的恢复作用，证实铁死亡参与。GO/KEGG富集分析显示药物-疾病交集靶点显著富集于氧化应激、谷胱甘肽代谢和铁死亡相关通路，NFE2L2（Nrf2）和GPX4为核心靶点。分子对接预测黄芩素与Nrf2、SLC7A11、GPX4的对接能量分别为?7.5、?8.0、?7.5 kcal/mol。
**2.5 分子动力学模拟进一步验证预测的黄芩素-靶点复合物稳定性**：100 ns模拟中，Nrf2-黄芩素、SLC7A11-黄芩素、GPX4-黄芩素复合物的RMSD、RMSF、SASA、氢键及自由能景观均显示总体稳定，支持计算模型的可靠性。
**2.6 ML385通过抑制Nrf2–SLC7A11–GPX4轴减弱黄芩素介导的抗铁死亡保护**：ML385（1 μM）部分逆转黄芩素对HG+PA条件下AC16细胞活力的恢复；ML385减弱黄芩素对GSH/GSSG比值的恢复、对MDA和Fe²⁺水平的降低、对脂质过氧化的抑制；ML385部分逆转黄芩素对ACSL4和PTGS2 mRNA表达的下调，以及对Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达的恢复。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究在体外细胞模型中证实黄芩素通过抑制铁死亡保护心肌细胞，但其局限性包括：仅使用体外模型，无法完全模拟体内DCM的复杂代谢、炎症和血流动力学环境；Nrf2参与的证据主要基于药理学抑制剂ML385，缺乏基因敲除或过表达实验；分子对接和模拟仅提供计算预测，未证实直接结合；HG+PA损伤涉及多种应激通路，铁死亡与其他细胞死亡形式的交互有待进一步研究。研究结论认为，黄芩素减轻HG+PA诱导的心肌细胞糖脂毒性损伤，其保护作用与减少氧化损伤、脂质过氧化和细胞内Fe²⁺蓄积，以及恢复Nrf2/SLC7A11/GPX4轴密切相关。ML385的部分逆转表明Nrf2依赖性信号在黄芩素保护中起重要作用但非唯一途径。多项铁死亡相关指标的一致性变化支持铁死亡过程的参与。计算分析提出黄芩素可能与Nrf2、SLC7A11或GPX4相互作用的可测试结构假说，但不应视为直接靶点结合的证据。这些发现为黄芩素在糖尿病代谢应激相关心肌细胞损伤中的保护潜力提供了机制支持，需进一步体内研究评估其治疗价值，并需遗传学功能获得/缺失实验和靶点结合分析明确其通路依赖性和直接分子靶点。