《Polymers》：Separation of Light and Heavy Rare Earth Elements via Electrospun Supported Liquid Membrane
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糖尿病肾病（DKD）仍是2型糖尿病（T2DM）最严重的微血管并发症之一，也是全球慢性肾脏病（CKD）的主要病因。尽管在其分子背景方面取得了显著进展，但当依赖传统的临床生物标志物如白蛋白尿和估算肾小球滤过率（eGFR）时，早期诊断和疾病进展的准确分层仍具挑战。越
糖尿病肾病（DKD）仍是2型糖尿病（T2DM）最严重的微血管并发症之一，也是全球慢性肾脏病（CKD）的主要病因。尽管在其分子背景方面取得了显著进展，但当依赖传统的临床生物标志物如白蛋白尿和估算肾小球滤过率（eGFR）时，早期诊断和疾病进展的准确分层仍具挑战。越来越多的证据表明，DKD由相互关联的致病机制驱动，包括慢性高血糖、蛋白激酶C（PKC）信号通路激活、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）失调、氧化应激、炎症级联反应以及涉及Toll样受体（TLR）和NLRP3炎症小体的免疫系统激活。这些过程共同导致内皮功能障碍、足细胞损伤、细胞外基质积累和进行性肾纤维化。外泌体及其分子货物，特别是微小RNA（miRNA），已成为有前景的调节因子和反映持续肾损伤的非侵入性生物标志物。尿液外泌体微小RNA（uEV-miRNA）因其在生物体液中的稳定性以及直接来源于肾单位片段而受到关注，能够实时反映肾脏病理生理学。积累的研究表明，差异表达的微小RNA（miRNA），包括miR-21-5p、miR-30a-5p、miR-192-5p和miR-142-3p，与DN中的关键通路密切相关。然而，其临床转化仍受到方法学异质性、缺乏标准化分离方案以及在大规模纵向队列中验证不足的限制。本综述梳理了DKD分子机制的当前知识现状，并探讨了uEV-miRNA作为诊断生物标志物的新兴作用。总之，uEV-miRNA为改善DKD的早期检测、风险分层和疾病监测提供了一条有前景的途径。
1. 引言
2型糖尿病（T2DM）因患病率上升及慢性并发症（降低生活质量、增加早期死亡率）成为全球健康挑战。糖尿病相关血管并发症（包括肾脏、视网膜、心脏、脑及下肢的微血管和大血管病变）是导致严重临床结局和死亡的主要原因。国际糖尿病联盟（IDF）数据显示，高达40%的糖尿病患者发展为慢性肾脏病（CKD），使糖尿病成为全球CKD的首要病因。糖尿病肾病（DKD）的发病机制复杂且多因素，关键风险因素包括慢性高血糖、动脉高血压、血脂异常、遗传易感性和不良生活方式。从T2DM诊断到晚期肾衰竭通常需要10-20年，纵向研究显示平均病程约14年。持续高血糖是启动肾小球和肾小管细胞有害变化的主要代谢触发器。高血糖诱导的细胞损伤由晚期糖基化终末产物（AGEs）、血管紧张素II、转化生长因子-β（TGF-β）、结缔组织生长因子、血管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及其他促纤维化和促炎分子加剧。这些介质通过连接细胞内信号通路起作用，其中蛋白激酶C（PKC）通路是高血糖信号的关键转导者。使用缺乏经典PKC-α和PKC-β亚型的双敲除细胞的实验研究证明了它们在DKD发展中的关键作用。这些亚型的缺失与白蛋白尿减少、肾小球肥大减轻、转化生长因子-β1（TGF-β1）表达降低及氧化应激减少相关，突出了PKC依赖性信号在DKD发病机制中的核心作用。高血糖下PKC的激活与代谢失调密切相关，特别是多醇通路通量增加和二酰甘油（DAG）合成增加。细胞内山梨醇积累和氧化还原失衡驱动氧化应激和AGE形成，进一步加剧PKC介导的信号传导。RAAS（调节血压和体液平衡）在DKD的实验和临床研究中被广泛研究。高血糖促进肾脏内RAAS的激活，表现为肾小球和肾小管中血管紧张素原、肾素和血管紧张素II受体的产生增加。血管紧张素II刺激NADPH氧化酶，导致活性氧（ROS）产生增加，支持RAAS是DKD中血流动力学变化与分子炎症通路之间关键联系的概念。除了RAAS介导的血流动力学失调外，免疫炎症机制进一步加剧肾损伤。高血糖和过度氧化应激触发Toll样受体（TLR2和TLR4），进而激活核因子κB（NF-κB）通路并维持促炎物质活性。其中，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体被密切研究。激活后，它通过caspase-1促进白细胞介素-1β和白细胞介素-18的成熟，增加炎症并损伤肾小球和肾小管间质区域。炎症小体活性创造促炎环境，加速肾损伤。尽管对致病机制的理解有所进展，但DKD的临床病程仍高度异质。并非所有糖尿病患者都出现肾脏受累。在DKD患者中，进展速度差异显著。值得注意的是，即使血糖控制良好，肾功能也可能持续下降，部分原因可能是“代谢记忆”——先前的高血糖暴露诱导长期分子改变，这些改变独立于当前血糖状态持续炎症和纤维化过程。尽管白蛋白尿和eGFR仍是使用最广泛的临床指标，但它们常无法识别早期分子变化，也不能完全反映疾病异质性。在此背景下，外泌体已成为细胞间通讯的重要中介，携带蛋白质和miRNA等生物活性分子，反映主要病理生理过程。其中，外泌体miRNA因其在生物体液中的稳定性以及在糖尿病并发症发展关键信号通路中的调节作用而特别受关注。然而，当前研究受限于缺乏标准化分离和归一化方案、分析平台异质性以及队列间可重复性不足。关于尿液和循环血液中外泌体miRNA（uEV-miRNA）特征的差异尚未达成共识。因此，uEV-miRNA作为糖尿病肾损伤的潜在调节因子和生物标志物受到越来越多的关注。几篇近期综述已涉及细胞外囊泡和miRNA在DKD中的作用，但大多聚焦于一般外泌体生物学、循环miRNA或特定分子通路，未对uEV-miRNA作为诊断生物标志物进行系统、批判性评估。此外，2024-2026年间证据的快速积累，包括系统综述识别出DKD中超过197个uEV来源的miRNA，突显了进行全面综合的必要性，以批判性评估其诊断性能、跨队列可重复性、对DKD相对于其他肾脏疾病的特异性以及组合面板的潜在效用。本综述提供了独特且及时的贡献：（i）系统评估10种具有诊断潜力的uEV-miRNA；（ii）比较uEV-miRNA与循环外泌体miRNA、尿液蛋白生物标志物和代谢组学方法；（iii）整合基于MISEV2023指南和MIQE指南的方法学标准化框架；（iv）提供临床转化的实用路线图，包括监管考虑因素及与传统临床标志物的整合。通过综合最新证据并解决临床实施的关键障碍，本综述旨在为早期检测、改善风险分层和DKD个性化管理提供有价值的视角。本综述的目标是突出uEV-miRNA作为DKD诊断和预后生物标志物的作用，并更新糖尿病并发症（特别是DKD）分子机制和发病机制的当前知识。
2. 糖尿病并发症与常见致病机制
近期研究表明，慢性炎症是糖尿病及其并发症发生发展的关键驱动因素。炎症介质如NF-κB、Toll样受体（TLR）、MAPK、JAK/STAT和PI3K/Akt通路已被确定为这些并发症的促成因素。因此，理解炎症的分子机制对于阐明糖尿病与其并发症之间的关系至关重要。
2.1. Toll样受体通路
在此背景下，糖尿病中的慢性代谢应激激活先天免疫信号通路，进一步维持肾炎症。先天免疫应答的特异性主要由Toll样受体（TLR）家族介导。TLR是高度保守的跨膜受体，主要表达于免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞。TLR作为先天免疫系统的模式识别受体，检测各种成分。TLR的激活触发细胞内信号级联反应，刺激编码促炎细胞因子的基因表达，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素IL-1、IL-6和IL-12，以及干扰素IFN-α/β，并促进共刺激分子和其他免疫应答介质的表达。除了宿主防御作用外，TLR还与T2DM的炎症和胰岛素抵抗相关。重要的是，TLR检测在应激、高血糖和糖脂毒性中产生的病原体相关分子和损伤相关分子（PAMPs和DAMPs）。这些信号有助于糖尿病中持续的、低水平的炎症。在TLR家族中，TLR2和TLR4是DKD发病机制和并发症的关键受体。刺激TLR2和TLR4触发涉及适配蛋白和激酶的细胞内通路，导致NF-κB、AP-1、IRF和JAK/STAT等转录因子的持续激活。在高血糖条件下，肾损伤促进DAMPs的释放，激活肾细胞中的TLR2/TLR4信号。临床证据进一步支持Toll样受体信号在DN发展中的作用，显示DKD和终末期肾病患者中TLR2和TLR4表达增加。TLR2/TLR4表达升高与促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IFN-γ）和C反应蛋白的循环水平增加相关，表明先天免疫激活与全身炎症之间的强关联。这些受体不仅有助于炎症反应的放大，还参与代谢失调和进行性肾损伤。
2.1.1. NLRP3炎症小体
NLRP3炎症小体激活很重要；受体寡聚化导致多蛋白复合物的形成，该复合物通过caspase-1激活介导IL-1β和IL-18的成熟和分泌——这是炎症的关键介质。在NLR家族中，NLRP3是研究最充分的成员之一，作为炎症小体形成的关键传感器。炎症小体激活由细胞内和细胞外信号触发，研究表明活性氧（ROS）驱动的线粒体损伤直接驱动NLRP3激活。NLRP3炎症小体的激活及其后的IL-1β产生被认为是T2DM及其并发症发病机制中的重要机制。实验研究表明，巨噬细胞分泌的IL-1β可影响胰岛素分泌和葡萄糖代谢。在生理水平上，IL-1β可能有助于葡萄糖稳态调节；然而，该通路的慢性或过度激活会促进炎症反应和β细胞功能障碍。此外，研究表明β细胞高表达IL-1受体（IL-1R1），包括IL-1β在内的炎症细胞因子诱导内质网应激并损害β细胞功能。相反，IL-1β通过减少IRS-1磷酸化损害胰岛素信号转导，最终导致胰岛素抵抗。持续的细胞因子信号不仅影响胰岛素产生细胞，还触发细胞内应激通路，放大氧化损伤。近期综述指出，炎症信号通路（包括NF-κB和MAPK）导致β细胞功能障碍和凋亡，进而促进糖尿病炎症。同时，虽然NF-κB在生理条件下对维持β细胞功能至关重要，但其过度激活直接损害胰岛素分泌并诱导代谢功能障碍。这些代谢紊乱直接诱导氧化应激，而线粒体功能障碍和内质网应激进一步放大ROS产生。过度氧化应激中断β细胞功能中的关键信号通路，激活应激相关激酶如AMP活化蛋白激酶（AMPK）和c-Jun N端激酶（JNK）。这些变化导致胰岛素分泌受损和β细胞功能障碍增加。来自高血糖刺激的巨噬细胞的外泌体被系膜细胞内化，导致促炎细胞因子激活和NLRP3炎症小体刺激，伴有自噬通量受损。类似地，携带表观遗传调节因子如METTL14的M1巨噬细胞来源的细胞外囊泡（EV）可通过m6A依赖的靶基因调节加剧肾小球内皮细胞的氧化应激、凋亡和炎症损伤。肾小管上皮细胞（TEC）来源的EV也在形成肾炎症中发挥核心作用。在糖尿病条件下，TEC来源的外泌体可通过NF-κB相关信号通路促进巨噬细胞向促炎M1表型极化。
2.1.2. 脂肪组织炎症的作用
在大多数人群中，T2DM与肥胖相关。代谢紊乱引起病理变化和β细胞损伤，包括葡萄糖升高、高胰高血糖素血症、高甘油三酯、游离脂肪酸升高、氧化应激和持续的免疫激活，所有这些都驱动炎症。人类和动物研究显示，在肥胖和糖尿病中，脂肪组织中的NLRP3激活。在脂肪组织中，多种细胞类型在触发时激活NLRP3炎症小体，从而损害代谢控制。大多数研究还显示，肥胖者脂肪组织中NLRP3和IL-1β增加。糖尿病中的全身代谢炎症是由胰岛素抵抗和脂肪组织功能障碍驱动的全身性炎症状态。相比之下，uEV指示肾脏特异性分子反应。这些隔室是相互关联的，因为全身细胞因子调节细胞外囊泡的生物发生和货物组成，而uEV相关信号反映肾细胞内NF-κB和NLRP3等炎症通路的激活。
2.2. T2DM中的氧化应激
与炎症一起，氧化应激被认为是T2DM及其并发症发病的主要机制之一。它由ROS引发的自由基氧化过程驱动。超氧阴离子自由基（O
2•?）、羟基自由基（•OH）和一氧化氮（NO）是最重要且研究最充分的ROS。ROS的有害作用被强大的抗氧化防御系统抵消。在生理条件下，ROS产生与抗氧化能力之间保持平衡。然而，慢性高血糖导致氧化应激并打破这种平衡。结果，产生过多的ROS，激活脂质过氧化，积累高毒性氧化产物。这些过程促进胰岛素抵抗的发展。随后抗氧化防御成分（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和NADPH）活性的降低进一步加速了糖尿病并发症的进展。线粒体功能障碍与DN的发生发展有关，尤其影响肾小管上皮细胞（TEC），这些细胞具有高代谢需求，依赖线粒体氧化磷酸化产生ATP。miRNA是调节基因表达的小分子，对氧化应激和线粒体功能障碍高度敏感，并作为肾损伤的氧化还原敏感调节因子。受损的肾细胞将这些miRNA包装到细胞外囊泡（EV）中，然后释放并被邻近或远处的肾细胞摄取。这种细胞外囊泡介导的信号允许细胞间转移氧化还原敏感的miRNA，促进氧化还原失衡的传播并推动肾功能障碍的进展。氧化应激代表了代谢炎症与血管损伤之间的关键机制联系，尤其影响内皮稳态。
2.3. 内皮功能障碍
内皮功能障碍与持续高血糖密切相关。在此条件下，葡萄糖通过多醇途径代谢，导致山梨醇积累。葡萄糖转化为山梨醇消耗NADPH。NADPH是谷胱甘肽抗氧化系统和一氧化氮合酶（NOS）所必需的。结果，一氧化氮（NO）生物利用度降低，到达血管平滑肌细胞的NO减少。同时，NO与超氧阴离子反应形成过氧亚硝酸盐（ONOO
?）。过氧亚硝酸盐随后分解为反应性物种，如二氧化氮和羟基自由基。这些反应性中间体直接损伤内皮细胞。氧化低密度脂蛋白（LDL）和溶血磷脂酰胆碱抑制L-精氨酸-eNOS通路。高胆固醇血症增加超氧化物产生，进一步降低NO水平并破坏血管稳态。此外，活性氧激活精氨酸酶II。精氨酸酶II将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸和尿素，因此可用的L-精氨酸减少，导致NO产生减少。除了激活多醇通路外，升高的葡萄糖水平还刺激二酰甘油-蛋白激酶C（PKC）通路，进而导致多种下游效应：增加血管通透性和损害内皮依赖性血管舒张。PKC激活进一步增强血管内皮生长因子（VEGF）表达，促进血管重塑。另外，NF-κB激活增加促炎细胞因子的产生。因此，这些不同的通路展示了多种因素如何通过各种机制促进内皮功能障碍。
3. 糖尿病肾病（DKD）
糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的严重肾脏并发症，特征为结节性或弥漫性肾小球硬化，导致慢性肾衰竭。并非所有T2DM患者都出现典型的DKD特征。在许多情况下，肾损伤以纤维增生性改变和肾内血管病变为特征，而非经典的肾小球受累。DKD的发展受不可改变和可改变的风险因素影响。不可改变因素包括糖尿病病程和遗传易感性，而可改变因素包括高血糖（HbA1c水平）、动脉高血压和血脂异常。DKD的发展有不同阶段。其复杂的病理生理机制主要通过临床前测试仍在阐明中。高血糖是糖尿病肾病发病的主要触发因素，结节性肾小球硬化代表形态学变化的最终阶段。它促进肾小球蛋白的糖基化，可能刺激系膜细胞增殖、细胞外基质积累和血管内皮损伤。高血糖与显著的血管内皮生长因子（VEGF）激活相关，通过多种机制在疾病早期促进肾小球硬化的发展。慢性高血糖的发展触发一系列事件，对DKD进展至关重要。它引发分子和血流动力学紊乱的级联反应，包括信号通路激活、氧化应激和晚期糖基化终末产物（AGEs）的形成。病理生理学上，这些过程导致肾组织结构损伤，如蛋白尿、纤维化和肾小球硬化，从而促进肾衰竭的进展。进行性肾小球硬化和肾血流量减少降低了功能性肾单位的数量。肾单位减少意味着对剩余肾单位的压力更大，从而激活RAAS。高血糖触发足细胞产生更多AT1、肾素前体和盐皮质激素受体，使这些细胞对RAAS信号更敏感。血管紧张素II随后引起出球小动脉收缩、肾小球内压力增加和基底膜通透性增加，加速瘢痕形成并恶化肾病。
传统临床生物标志物在早期疾病检测中的局限性
DKD的典型临床表现是持续性白蛋白尿（AU）超过30 mg/天，且无感染、发热、剧烈体力活动、未控制的高血压或心力衰竭等情况。在T2DM患者中，DKD的病理生理进展并不总是典型的。白蛋白尿传统上被认为是DKD的首个临床体征，因此被用作筛查测试。近期研究分析了T2DM患者白蛋白尿的个体变异性，以支持临床监测并评估其在DKD评估中的核心作用。根据现有数据，尿白蛋白-肌酐比值在个体内逐日变化。这种变异性给白蛋白尿的评估和解释带来挑战，因为日常波动可能无法与治疗引起的波动区分。白蛋白尿的变异性与发生持续性白蛋白尿及相关并发症的风险增加相关。横断面分析显示，T2DM患者尿白蛋白-肌酐比值表现出显著的个体内变异性，这严重复杂化了白蛋白尿水平变化的解释，并表明需要多次测量以确保更可靠的长期临床监测。血清肌酐是糖尿病肾病的晚期指标，并受肌肉质量、年龄和性别影响。该参数仅在肾功能显著下降时升高。然而，近期研究表明，许多T2DM患者表现出eGFR下降而无显著白蛋白尿，这种现象称为非白蛋白尿性糖尿病肾病（NA-DKD）。NA-DKD通常以进展较慢为特征。血糖和血压控制不佳、白蛋白尿较高、DKD病程较长、年龄较大、男性、吸烟、血脂异常、肥胖和心血管合并症等因素与DKD快速进展相关。鉴于这些特征，进一步研究NA-DKD的特征和潜在机制很重要。NA-DKD以独特的临床表型为特征，表现为肾功能下降而无或仅有微量白蛋白尿。其潜在病理生理机制以血管病变为主，包括糖尿病大血管病变，反映血管损伤的系统性。此外，反复或未完全缓解的急性肾损伤发作可能促成此表型。此外，许多研究强调了肾小管间质损伤的作用，这种损伤可独立于肾小球标志物发生，强调了肾损伤中非肾小球机制的重要性。尿液胶原蛋白及其代谢产物的排泄动力学也可能是DKD的标志物。其状态可通过测量尿液中不同类型胶原蛋白及其代谢产物的水平来评估。在涉及254名T2DM患者的横断面研究中，评估了尿液中IV型胶原蛋白水平与DKD进展及8年内eGFR年下降率的关系。尿IV型胶原蛋白排泄增加与肾功能恶化相关，并显著与eGFR下降率相关，即使在无显性蛋白尿的情况下也是如此。尽管该参数可靠地反映了肾功能下降率，但长期来看，它不能预测DKD向更晚期阶段的进展。对于DKD的诊断，需要早期生物标志物，特别是通过整合新的分子指标，包括miRNA、炎症标志物、氧化应激标志物和外泌体。外泌体包含功能性miRNA和蛋白质，反映细胞间通讯和肾脏潜在的病理过程，如炎症和氧化损伤。它们通过诱导肾损伤、凋亡、炎症和纤维化在DKD发病机制中发挥作用。因此，组合生物标志物面板可能比传统标志物更敏感和特异，用于早期诊断和预测疾病进展。
4. 外泌体
外泌体是由不同组织和器官细胞释放的微小囊泡。它们携带蛋白质、脂质、RNA和其他分子。外泌体促进运输、组织再生、免疫调节和细胞废物清除。它们的大小为30-150 nm，在细胞内形成，并通过多囊泡体胞吐作用释放。两种主要机制产生外泌体：一种是依赖内体分选复合物-转运所需（ESCRT）的通路，将蛋白质分选到内体中，形成腔内囊泡并释放；另一种是非ESCRT依赖的通路，涉及四跨膜蛋白如CD9、CD81和CD63。外泌体通过将分子货物递送至靶细胞介导细胞间通讯。在糖尿病中，外泌体转移降低胰岛素敏感性和激活巨噬细胞的miRNA，进而影响胰腺β细胞并损害胰岛素分泌，导致DKD。尽管外泌体携带多种分子，但近期研究强调miRNA是其活性的关键调节因子。鉴于miRNA参与转录后基因调控的分子和功能特征，研究外泌体miRNA组分是开发现代诊断策略的有前景的方法。
4.1. 外泌体miRNA作为DKD的生物标志物
外泌体miRNA因其反映肾脏内持续分子改变的能力，已成为DKD研究的重要焦点。作为调节分子，miRNA通过转录后调节基因表达影响众多生物通路，从而影响细胞稳态和应激反应。它们整合到外泌体提供了额外的生物稳定性并促进了靶向细胞间通讯，使这些分子能够介导肾细胞、免疫细胞和血管细胞之间的信号传导。在糖尿病条件下，葡萄糖代谢紊乱改变外泌体组成和分泌，导致miRNA谱失调。这些外泌体相关miRNA已涉及DKD的核心过程，包括炎症激活、氧化失衡、细胞外基质积累和进行性纤维化。由于外泌体释放到尿液和循环中，其分子内容可能反映传统临床表现变得明显之前的早期肾损伤。外泌体miRNA因其高生物特异性以及在体液中抵抗降解的能力而越来越多地被识别为生物标志物。与传统肾脏标志物（常无法检测早期或非白蛋白尿性疾病）不同，外泌体来源的miRNA提供了对亚临床分子水平病理过程的有价值洞察。因此，表征外泌体miRNA特征有望促进早期诊断、改善风险评估和增强DKD进展监测。miRNA转运到外泌体中受多种RNA结合蛋白调节，包括hnRNPA2B1和hnRNPA1。相反，外泌体miRNA释放到细胞外空间主要由神经酰胺介导。一项临床研究表明，DKD患者表现出独特的循环外泌体miRNA谱。该谱与白蛋白尿以及涉及血管生成、炎症和MAPK信号的通路相关，突出了外泌体miRNA在疾病发病机制和生物标志物发现中的潜在作用。研究表明，DKD患者尿液中外泌体的生化组成与健康个体显著不同。
4.2. 尿液外泌体miRNA研究
尿液外泌体（uEV）主要由肾单位各部分的细胞产生，包括足细胞、近端肾小管细胞、系膜细胞和内皮细胞。尿液收集无风险，允许重复、纵向采样。近期综述将超速离心、沉淀试剂盒和尺寸排阻色谱（SEC）确定为uEV分离的主要方法，各方法在效率、纯度和可重复性方面不同。其中，超速离心被认为是“金标准”，尽管劳动密集且可能显示样本间变异性。相比之下，沉淀试剂盒提供快速便捷的替代方案，但特异性较低，而SEC通过根据流体动力学尺寸分离囊泡提供更高纯度。最近，免疫亲和捕获和微流控技术被引入，以进一步提高外泌体分离工作流程的特异性、效率和标准化。uEV源自肾脏和泌尿生殖细胞，通过囊泡包裹保护RNA。其分子内容（包括miRNA）可反映DKD肾组织的局部病理变化。与无肾损伤的T2DM患者和健康个体相比，DKD患者uEV中miR-142-3p表达增加，提示与进行性肾功能障碍密切相关。重要的是，其水平不仅反映疾病存在，还与蛋白尿严重程度和慢性肾脏病分期相关。尿液miR-192-5p在DKD患者中显著改变。它与血清肌酐呈正相关，与估算肾小球滤过率呈负相关。这些发现表明其作为非侵入性生物标志物的潜在作用，与肾功能下降和DKD严重程度相关。尿液外泌体miR-21-5p是DKD中最一致上调的miRNA之一。具体而言，临床研究显示其在DKD患者中的表达高于无肾病的糖尿病患者和健康对照。机制上，miR-21-5p与TGF-β/Smad信号、上皮-间充质转化（EMT）和SMAD7抑制密切相关，这些均有助于肾纤维化。此外，miR-21-5p水平与肾功能下降相关，表明其作为CKD和DKD疾病严重程度和进展风险标志物的潜力。另一项研究数据进一步支持miR-21-5p在DKD中的功能作用，证明血浆和肾小管细胞来源的富含miR-21-5p的小EV发挥类似的生物效应，促进高糖条件下近端肾小管细胞的增殖、迁移和上皮-间充质转化。尿液外泌体miR-30a-5p在糖尿病肾病中表达降低，而在局灶节段性肾小球硬化中观察到水平升高，提示疾病特异性调节机制和肾脏病理生理学中的潜在作用。在T2DM和DKD患者队列中，miR-30a与疾病严重程度标志物相关，与糖化血红蛋白、血压、血脂谱、血清肌酐和尿白蛋白-肌酐比值呈正相关，与eGFR呈负相关。值得注意的是，在一部分正常白蛋白尿患者中也检测到miR-30a表达改变。除了这四种广泛验证的miRNA外，近期系统综述和生物信息学分析还识别出几种在DKD中持续失调的额外尿液外泌体miRNA。其中，miR-29a-3p和miR-126-3p在DKD患者中显著下调，与无肾脏并发症的糖尿病患者和健康对照相比。两种miRNA在功能上与凋亡、纤维化和细胞外基质积累的调节相关，突出了它们在DKD发病机制中的潜在作用。miR-342-3p是DKD中另一种持续失调的miRNA，在DKD患者尿液外泌体中表达增加，并在有效治疗后下降。机制上，miR-342-3p参与caspase-1信号通路并调节SOX6/TGF-β1轴，促进肾炎症和纤维化。其表达与临床参数（包括间质纤维化、血清肌酐和蛋白尿水平）相关。此外，尿液外泌体miR-133b在早期2型糖尿病肾病中表达升高，早期DKD患者中报告倍数变化为2.26。类似地，miR-145-5p在DKD患者尿液外泌体中显著上调，与UACR呈正相关（r = 0.801），与eGFR呈负相关（r = -0.784）。机制上，miR-145-5p靶向Srgap2并激活ROCK通路，导致足细胞功能障碍和肾纤维化。这些发现表明，包含这些miRNA的多面板方法可能提高DKD诊断准确性和预后评估。表2总结了DKD中主要uEV-miRNA的表达模式和临床相关性。
4.3. 尿液细胞外囊泡来源miRNA与其他生物标志物的比较
4.3.1. uEV-miRNA与DKD其他生物标志物的比较
uEV-miRNA因其高生物稳定性、肾脏特异性来源以及反映早于显性临床表现的早期分子改变的能力，已成为DKD有前景的生物标志物。与现有生物标志物相比，uEV-miRNA提供若干潜在优势并补充现有诊断方法。
4.3.2. 与循环外泌体miRNA的比较
uEV-miRNA相对于循环外泌体miRNA的主要优势之一是其组织特异性。循环miRNA源自多个器官，反映全身代谢和炎症过程，而uEV-miRNA主要由肾上皮细胞、足细胞、系膜细胞和其他肾单位驻留细胞群体释放。因此，其分子货物更准确地代表肾脏内发生的局部病理事件。循环miRNA在DKD中表现出中等诊断性能，荟萃分析报告汇总受试者工作特征曲线下面积（AUC）约为0.79。然而，比较细胞外囊泡相关和细胞游离miRNA的研究一致表明，EV来源miRNA具有优越的诊断性能、更高的丰度和更大的分析稳定性，因为囊泡包裹保护RNA免受RNase介导的降解。这些特性使uEV-miRNA成为非侵入性评估肾脏特异性病理过程特别有吸引力的候选。
4.3.3. 与尿液蛋白质生物标志物的比较
传统尿液生物标志物，包括白蛋白尿和eGFR，仍然是DKD诊断和监测的基石。然而，两者主要反映已经发生的结构性肾损伤，可能无法在疾病进展的最早阶段识别患者。相比之下，uEV-miRNA可以检测先于显性肾功能障碍的分子改变。实验和临床研究表明，特定的尿液外泌体miRNA在显著蛋白尿发展之前与肾纤维化、炎症、氧化应激、肾小管损伤和肾小球肥大密切相关。此外，与未分级的尿液样本相比，尿液细胞外囊泡的富集显著提高了几种纤维化相关miRNA的检测灵敏度。重要的是，多项研究表明，即使在正常白蛋白尿个体中，uEV-miRNA特征也能准确识别肾功能快速下降的患者，实现高灵敏度和特异性。这些发现表明，uEV-miRNA可能通过识别临床可检测白蛋白尿出现前的高危患者来补充传统生物标志物。
4.3.4. 与代谢组学生物标志物的比较
代谢组学分析通过表征与疾病进展相关的代谢紊乱，代表了识别DKD早期生物标志物的另一种有前景的策略。然而，尿液代谢组学生物标志物与uEV-miRNA之间的直接比较仍然有限。尽管代谢组学提供了代谢改变的全面概述，但miRNA分析通过识别负责疾病进展的调节机制提供了补充信息。与代谢物不同，miRNA直接调节基因表达并参与涉及炎症、纤维化、氧化应激、线粒体功能障碍和细胞外基质重塑的信号通路。因此，这两种方法应被视为互补而非竞争。
4.3.5. 整合生物标志物策略
当前证据表明，uEV-miRNA不太可能取代既定的临床生物标志物，而是代表改进早期诊断、预后评估和患者分层的宝贵补充工具。将uEV-miRNA特征与常规临床参数（包括eGFR、白蛋白尿、糖化血红蛋白（HbA1c）和血压）相结合的整合诊断模型，一致显示优于单独生物标志物的诊断和预后性能。此外，同时表征uEV内的多种分子组分（包括miRNA、蛋白质、脂质和代谢物）催生了多组学方法，这越来越被认为是生物标志物发现的有前景方向。这种整合分析能够更全面地评估DKD进展背后的复杂分子机制，并可能促进开发高度敏感和特异的生物标志物面板，用于早期诊断、疾病监测、风险分层和个性化治疗决策。总体而言，积累的证据表明，uEV-miRNA代表了DKD当前生物标志物库的重要补充。其肾脏特异性来源、高分子稳定性和捕获早期致病改变的能力支持其潜在的临床实用性，特别是当整合到多模式和组学诊断框架中时。
4.4. uEV-miRNA分析的方法学挑战与标准化
尽管有前景的发现，uEV-miRNA的临床应用仍因缺乏标准化方法而受限。具体而言，前分析阶段
