临床分离伊丽莎白菌（Elizabethkingia）的综合表型特征分析及二醛纤维素（Dialdehyde Cellulose, DAC）抗菌与抗生物膜活性评价

《International Journal of Molecular Sciences》：Comprehensive Phenotypic Characterization of Clinical Elizabethkingia Isolates and Evaluation of the Antimicrobial and Anti-Biofilm Activity of Dialdehyde Cellulose

　　

伊丽莎白菌（Elizabethkingia）属物种已成为重要的医院内病原体，与多重耐药（Multidrug Resistance, MDR）及持续性感染相关。本研究旨在对泰国北部临床分离的伊丽莎白菌进行抗菌药物敏感性、毒力相关表型及生物膜形成的表征，并评估二醛纤维素（Dialdehyde Cellulose, DAC）薄膜的抗菌与抗生物膜活性。研究人员共收集49株临床分离株，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）进行鉴定，并通过16S rRNA基因测序确认物种。研究人员测定了其对12种抗菌药物的敏感性，采用标准表型试验评估毒力特征（蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶及溶血素产生）与生物膜形成能力，并评估了DAC薄膜对选定耐药分离株的作用。结果显示，嗜蚊伊丽莎白菌（Elizabethkingia anophelis）占主导地位，大多数分离株表现为多重耐药或广泛耐药（Extensive Drug Resistance, XDR），对碳青霉烯类及头孢菌素类具有高耐药性。哌拉西林-他唑巴坦、左氧氟沙星及复方磺胺甲噁唑（Trimethoprim–Sulfamethoxazole, TMP/SMX）显示出最强的活性。所有分离株均表现出蛋白酶产生及时间依赖性溶血，而未检测到脂肪酶与卵磷脂酶活性。分离株间生物膜形成能力各异，DAC薄膜抑制了细菌生长并阻止了受试分离株中可检测到的生物膜形成。DAC与DAC联合美罗培南的抑菌圈直径无显著差异（p = 0.555）。临床伊丽莎白菌分离株表现出广泛的抗菌药物耐药性，伴有保守的毒力特征及异质性的生物膜形成。在实验条件下，DAC薄膜显示出抗菌活性并阻止了可检测的生物膜形成。研究人员需进一步研究其作用机制及潜在应用。

该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。伊丽莎白菌（Elizabethkingia）属为非发酵革兰氏阴性杆菌，属于威克斯氏菌科（Weeksellaceae），是免疫功能低下及危重患者中日益受重视的机会性病原体，可导致菌血症、肺炎、脑膜炎及器械相关感染等，发病率与死亡率较高。目前管理感染面临挑战，主要因其对β-内酰胺类、碳青霉烯类及氨基糖苷类等多重抗菌药物类别存在固有耐药，常由染色体编码的β-内酰胺酶及其他机制介导，导致治疗选择受限、延误恰当治疗并预后不良。此外，该菌属能在医疗器械及医院环境中持续存在，可能通过生物膜相关生存机制阻碍感染控制并促进传播。毒力特征如毒力酶产生有助于组织损伤与免疫逃逸，生物膜形成增强环境持久性与抗菌药物耐受性，促进慢性定植。不同地区该菌属的分布、耐药模式及毒力特征可能存在差异，因此区域性的抗菌药物敏感性及表型数据对理解本地种群特征、指导抗菌药物管理、制定感染控制策略及改善临床结局至关重要。鉴于生物膜相关持续存在是感染控制难点，兼具抗菌效应与防微生物附着的材料如二醛纤维素（Dialdehyde Cellulose, DAC）作为氧化纤维素衍生物，因生物相容性及功能改性潜力受到关注，其对抗多重耐药伊丽莎白菌的活性尚未被研究。为此，研究人员对泰国清迈大学医学院附属医院收集的临床伊丽莎白菌分离株进行流行病学、人口学、物种分布、临床来源、抗菌药物敏感性及表型特征（包括毒力酶产生与生物膜形成）的综合表征，并评估DAC的抗菌特性及其对选定分离株不同生物膜表型的抗生物膜效能。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：样本来源于泰国清迈Maharaj Nakorn Chiang Mai医院2021至2025年间的49例非重复临床分离株，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）初筛后采用16S rRNA基因测序确证物种；抗菌药物敏感性测试使用Sensititre? ARIS? 2X系统测定12种抗菌药物的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）并按CLSI标准判读，依据MDR与XDR定义分类；毒力酶（蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶）与溶血表型采用底物特异性琼脂定性分析；生物膜形成与DAC涂层抑制效应采用结晶紫（Crystal Violet）定量法于96孔板评估；DAC薄膜制备采用二醛纤维素与羟丙基甲基纤维素（Hydroxypropyl Methylcellulose, HPMC）混合成膜并负载美罗培南，经环氧乙烷灭菌；抗菌活性采用改良琼脂扩散法测量抑菌圈直径，统计学采用Mann–Whitney U检验与配对t检验分析。

2. Results

2.1. Characteristics of Elizabethkingia Isolates and Species Distribution

研究人员收集49株非重复分离株，78%来源于痰液，其余来自支气管肺泡灌洗液、血培养、导管尖端等。16S rRNA测序鉴定显示嗜蚊伊丽莎白菌（E. anophelis）41株占83.67%，脑膜炎伊丽莎白菌（E. meningoseptica）6株占12.25%，米尔科伊丽莎白菌（E. miricola）2株占4.08%。呼吸标本占优势与伊丽莎白菌属呼吸道定植及感染的相关认知一致。

2.2. Antimicrobial Susceptibility Profiles

研究人员测试12种抗菌药物，38株（77.55%）为MDR，9株（18.37%）为XDR，仅2株（4.08%）敏感。对碳青霉烯类与多数头孢菌素耐药显著，头孢他啶耐药率97.96%，亚胺培南85.72%，美罗培南89.8%，MIC₅₀/MIC₉₀均处于耐药范围（>16 μg/mL）。哌拉西林-他唑巴坦敏感率最高（91.84%），其次为左氧氟沙星（83.67%）与复方磺胺甲噁唑（81.63%），其MIC₅₀处于敏感范围（≤8、1、2 μg/mL）。三种物种中前述三药仍最有效，E. anophelis整体耐药谱更广，E. meningoseptica与E. miricola对环丙沙星敏感率高。

2.3. Phenotypic Characteristics: Enzyme Production, Hemolysis, and Biofilm Formation

所有分离株筛查毒力相关表型。蛋白酶活性普遍，24小时43株（87.76%）阳性，48小时全部阳性；E. anophelis在24小时阳性率90.24%，E. miricola为100%，E. meningoseptica为66.66%显示早期延迟。脂肪酶与卵磷脂酶在各时间点均无活性。溶血试验显示时间依赖性：24小时44株（89.8%）α溶血，5株无溶血；48小时46株（93.88%）α溶血，3株（6.12%）β溶血；72小时45株（91.84%）β溶血为主，4株α溶血。生物膜形成异质性高，超过半数（29株）为生产者，多数呈强表型（18/29）。E. anophelis异质性最高；E. meningoseptica中5/6为强生产者，1为非生产者，无中弱表型；E. miricola均为非生产者。

2.4. Antimicrobial Activity of Dialdehyde Cellulose (DAC) Film Against Elizabethkingia anophelis

2.4.1. Phenotypic Validation of Tested Isolates and Controls

选用4株E. anophelis代表不同生物膜表型。对照药敏盘显示对所有株TMP/SMX抑菌圈18.50 ± 0.87至24.33 ± 0.58 mm，美罗培南无抑菌圈确证耐美罗培南表型；参考株大肠杆菌（E. coli）与铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）对美罗培南抑菌圈大（34.67 ± 0.76 mm与32.67 ± 0.58 mm），大肠杆菌对TMP/SMX敏感（30.83 ± 0.76 mm）。

2.4.2. Antimicrobial Efficacy of DAC Against E. anophelis and Controls

DAC薄膜对所有4株E. anophelis产生抑菌圈22.33 ± 0.58至26.00 ± 2.08 mm；DAC联合美罗培南（DAC + meropenem）为23.17 ± 0.29至25.00 ± 1.00 mm。尽管美罗培南单药无活性，DAC均显示活性，抑菌圈数值与TMP/SMX相当，在CMEA36与CMEA89株甚至略大于TMP/SMX。重复测量变异低。

2.4.3. Statistical Evaluation of DAC-Meropenem Interaction

对比参考株，DAC与DAC+美罗培南对铜绿假单胞菌抑菌圈分别为9.67 ± 0.58 mm与9.00 ± 0.00 mm，远低于美罗培南的32.67 ± 0.58 mm；对大肠杆菌分别为9.33 ± 0.58 mm与11.50 ± 0.50 mm，亦远小于对照。E. anophelis株抑菌圈数值大于参考株但无统计学显著（Mann–Whitney U, p = 0.1333）。DAC与DAC+美罗培南抑菌圈直径无显著差异（配对t检验, p = 0.555），表明实验条件下掺入美罗培南未显著增强DAC活性。

2.5. Preliminary Evaluation of the Biofilm Inhibitory Effect of DAC-Coated Plates

研究人员选用4株具不同基线生物膜表型（中、弱、非、强）的E. anophelis评估DAC涂层板。对照组24小时均有可见生长且表型与结晶紫结果一致。暴露于DAC涂层薄膜后，所有4株E. anophelis生长被抑制，与固有生物膜表型无关；而大肠杆菌与铜绿假单胞菌在24小时仍可检测到生长。值得注意的是，尽管对照株有生长，但在DAC涂层板上未观察到可检测的生物膜形成，DAC薄膜抑制了所有测试株及对照株的生物膜形成。由于E. anophelis测试株生长完全被抑制，无法判断生物膜减少是源于直接抗生物膜效应还是继发于生长抑制。

讨论部分总结：研究人员讨论指出该研究表征了泰国北部临床伊丽莎白菌的抗菌药物敏感性、毒力相关表型及DAC的抗菌与初步抗生物膜潜力，支持该菌具广泛耐药及持久致病表型、DAC可作为控制生长与生物膜形成的替代策略。E. anophelis为优势种，与近期流行病学一致，强调分子鉴定重要性；呼吸道标本占优支持其与住院患者呼吸道定植感染相关。药敏显示MDR/XDR普遍，碳青霉烯与头孢菌素耐药高，哌拉西林-他唑巴坦、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑保留最高活性但MIC₉₀升高提示异质性，需分离株特异性测试指导治疗。毒力表型中蛋白酶普遍（全部48小时阳性），脂肪酶与卵磷脂酶缺如，与前人部分报道差异可能源于菌株背景与非组成型表达及培养条件；溶血呈时间依赖性（48小时α溶血为主，72小时转为β溶血为主），这些表型为保守种相关特征而非严重程度预测标志。生物膜形成常见但异质，近半数E. anophelis为非生产者，血源分离株多非生产，未见生物膜表型与药敏（哌拉西林-他唑巴坦等）及MDR/XDR分类显著关联，关系具菌株与药物依赖性。DAC对耐美罗培南E. anophelis具抗菌活性，抑菌圈与TMP/SMX相当，联合美罗培南无协同，可能因β-内酰胺在制膜或灭菌中降解或DAC本身活性掩盖；其机制或通过醛基与表面胺反应破坏结构，不同于常规抗生素故对耐药株仍有效。DAC在E. anophelis上完全抑制生长并阻止可检测生物膜，无法区分是否具生长非依赖性抗生物膜机制；对照株有生长但仍无生物膜提示此可能性需进一步验证（如并行活菌计数与生物膜量）。转化角度看DAC涂层具医疗器械表面改性潜力以预防微生物持久存在，亦可应用于伤口敷料与屏障材料。局限包括单中心、E. miricola仅2株、未探究分子机制与美罗培南稳定性、仅选部分药物、DAC为聚合物薄膜抑菌圈与小分子抗生素直接比较需谨慎及需后续扩散率验证与涂层稳定性、释放动力学、生物相容性等评估。

研究结论部分翻译：临床伊丽莎白菌（Elizabethkingia）分离株表现出广泛的抗菌药物耐药性，伴有保守的毒力特征及异质性的生物膜形成。在实验条件下，二醛纤维素（DAC）薄膜显示出抗菌活性并阻止了可检测的生物膜形成。研究人员需进一步研究其作用机制及潜在应用。