《International Journal of Molecular Sciences》：ST6GAL1 Glycoengineering Rewires Cytokine Signaling and Preserves Metabolic Fitness in CAR-T Cells Under Galectin-3-Mediated Immunosuppression
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嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出显著疗效；然而，持久反应仍受限于肿瘤微环境（TME）介导的免疫抑制。半乳糖凝集素-3（Gal-3），一种在TME中富集的β-半乳糖苷结合凝集素，通过损害细胞毒性、促进凋亡以及改变细胞信号传导，导致C
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出显著疗效；然而，持久反应仍受限于肿瘤微环境（TME）介导的免疫抑制。半乳糖凝集素-3（Gal-3），一种在TME中富集的β-半乳糖苷结合凝集素，通过损害细胞毒性、促进凋亡以及改变细胞信号传导，导致CAR-T细胞功能障碍。虽然研究人员先前证实，强制表达α2,6唾液酸转移酶ST6GAL1可减少半乳糖凝集素结合并改善CAR-T细胞功能，但这种保护作用的机制基础仍不清楚。在此，研究人员报告Gal-3在CAR-T细胞中诱导了一种低代谢状态，其特征为线粒体功能、ATP产生和葡萄糖利用降低。相比之下，过表达ST6GAL1的CAR-T细胞在Gal-3应激下保持了代谢适应度和功能弹性。此外，Gal-3通过增加IL-5表达和失调下游通路重塑了细胞因子信号，而强制表达ST6GAL1的CAR-T细胞表现出SOCS1和SOCS3表达增加以及STAT5激活减弱。来自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的CAR-T细胞转录组分析进一步揭示，与部分缓解者相比，完全缓解者中STAT5相关信号和SOCS1表达富集。总之，这些发现将糖工程确定为一种有前景的策略，可在Gal-3介导的免疫抑制应激下增强CAR-T细胞的持久性和功能。
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤治疗中取得了突破性进展，但肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制因子，尤其是半乳糖凝集素-3（Gal-3），严重限制了CAR-T细胞的持久性和抗肿瘤功能。Gal-3通过结合细胞表面糖链，损害细胞毒性、促进凋亡并扰乱信号传导。研究人员此前发现，过表达α2,6唾液酸转移酶ST6GAL1可减少Gal-3结合并改善CAR-T细胞功能，但其保护机制尚不明确。为阐明这一机制，研究人员在《International Journal of Molecular Sciences》发表论文，系统研究了ST6GAL1糖工程如何通过调控细胞因子信号和代谢适应度对抗Gal-3介导的免疫抑制。研究证实，Gal-3诱导CAR-T细胞进入低代谢状态，而ST6GAL1过表达可维持代谢弹性并重塑信号通路，为糖工程策略增强CAR-T细胞持久性提供了新见解。
研究人员采用的主要技术方法包括：RT-qPCR检测细胞因子信号相关基因表达；Western blot分析SOCS1蛋白水平；流式细胞术动态监测STAT5磷酸化（pSTAT5）；Seahorse细胞外通量分析仪评估线粒体呼吸和糖酵解；ATP定量和葡萄糖摄取测定；CCK-8增殖实验和基于荧光素酶的肿瘤杀伤实验；以及JAK抑制剂（JAK2 Inhibitor IV）药理学干预。此外，研究人员分析了公共转录组数据集GSE223655，该数据集来自接受CD19/CD20 TanCAR-T治疗的复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者，包括完全缓解（CR）、部分缓解（PR）和疾病进展（PD）组，通过差异表达分析和基因集富集分析（GSEA）评估临床相关性。
**研究结果**：
**2.1 ST6GAL1 改变 Gal-3 暴露后 CAR-T 细胞中细胞因子信号基因表达**
通过RT-qPCR，研究人员发现，与常规CAR-T细胞相比，经重组人Gal-3（rhGal-3）处理24小时后，ST6GAL1过表达的CAR-T细胞（ST6 CAR-T）中细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）和SOCS3的mRNA水平显著升高，而STAT5A表达显著降低，STAT5B、IL-5受体α链（IL5RA）和共同β链受体（CSF2RB）无显著变化。这表明ST6GAL1过表达促进了SOCS介导的负反馈转录特征。
**2.2 ST6GAL1 减弱 Gal-3 诱导的 STAT5 激活并促进 CAR-T 细胞中 SOCS1 反馈信号**
Western blot显示，rhGal-3刺激1小时后，ST6 CAR-T细胞中SOCS1蛋白表达显著高于对照。磷酸化流式检测发现，Gal-3诱导时间依赖性的pSTAT5升高，但常规CAR-T细胞在60分钟时的pSTAT5水平显著高于ST6 CAR-T细胞。这证实ST6GAL1表达与Gal-3介导的STAT5激活减弱和SOCS1反馈增强相关。
**2.3 ST6GAL1 糖工程在 Gal-3 富集环境中维持 CAR-T 细胞代谢适应度**
Seahorse分析显示，rhGal-3处理24小时显著抑制了CAR-T细胞的基础呼吸、基础糖酵解和总ATP产生速率，但未损害最大呼吸或储备呼吸能力。在配对分析中，ST6 CAR-T细胞在Gal-3存在下维持了更高的细胞内ATP水平和葡萄糖摄取，并表现出显著增强的补偿性糖酵解、基础呼吸和基础糖酵解，同时线粒体ATP和糖酵解ATP产生均优于对照。这表明ST6GAL1保护CAR-T细胞免受Gal-3诱导的代谢抑制。
**2.4 Gal-3 损害 CAR-T 细胞增殖，而 JAK 抑制部分恢复 Gal-3 应激下的细胞毒性功能**
CCK-8增殖实验显示，ST6 CAR-T细胞在Gal-3存在下48小时增殖能力显著强于常规CAR-T细胞。JAK抑制剂（1 μM）预处理30分钟后，Gal-3处理的常规CAR-T细胞肿瘤杀伤能力得到部分恢复，达到与ST6 CAR-T细胞相当的水平，而ST6 CAR-T细胞杀伤能力也略有增强。这支持JAK/STAT信号在Gal-3诱导功能障碍中的关键作用。
**2.5 独立 CAR-T 细胞转录组分析支持与临床结果相关的信号和代谢重塑**
分析GSE223655数据集发现，CR患者与PD患者之间存在大量差异表达基因。热图显示CR患者中SOCS1、SOCS3、STAT5A、STAT5B、糖酵解和线粒体代谢相关基因表达模式与PR患者不同。GSEA分析表明，CR患者中HALLMARK_IL2_STAT5_SIGNALING和HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE通路显著富集。SOCS1表达在CR患者中显著高于PR患者。这些结果支持STAT5/SOCS信号程序在CAR-T治疗反应中的临床相关性。
**讨论与结论**：
讨论部分指出，Gal-3通过诱导STAT5过度激活和代谢抑制（尤其是糖酵解通路）导致CAR-T细胞功能障碍，而ST6GAL1糖工程通过增强SOCS1/3表达、减弱STAT5磷酸化以及维持线粒体和糖酵解代谢适应度，提供保护作用。临床转录组数据进一步验证了IL-2/STAT5信号和炎症反应通路在完全缓解者中的富集，提示这些机制与临床疗效相关。研究存在局限性：Gal-3结合、STAT5激活、SOCS1诱导和代谢抑制之间的因果关系尚未直接证明；体外重组Gal-3模型可能无法完全模拟体内TME的复杂性；临床数据来自治疗后CAR-T细胞，与急性体外抑制条件存在生物学差异；不同CAR结构、共刺激域和疾病背景的适用性未知。结论部分翻译如下：本研究确定了STAT5/SOCS信号和代谢适应度是ST6GAL1糖工程在CAR-T细胞中保护作用的重要下游机制。研究人员证明Gal-3诱导失调的STAT5激活，抑制糖酵解和线粒体代谢，损害CAR-T细胞功能。相反，强制表达ST6GAL1增强了SOCS1和SOCS3表达，减弱了STAT5激活，维持了生物能量适应度，并提高了对Gal-3介导抑制的抵抗。这些发现与细胞因子信号和代谢编程是CAR-T细胞持久性和治疗疗效关键决定因素的新认识一致。此外，JAK/STAT信号的药理学抑制部分恢复了CAR-T细胞毒性，支持该通路在Gal-3诱导功能障碍中的功能作用。对独立临床CAR-T转录组数据集的分析进一步显示，在完全缓解患者中IL-2/STAT5信号和炎症反应通路富集，突显了这些发现的临床相关性。总之，这些结果支持一个模型，即α2,6-唾液酸化通过维持细胞因子信号稳态和代谢适应度保护CAR-T细胞免受Gal-3介导的免疫抑制。鉴于galectins作为肿瘤免疫逃避调节因子的既定作用，研究人员的发现进一步确立了糖工程作为改善CAR-T细胞在半乳糖凝集素富集肿瘤微环境中持久性和抗肿瘤疗效的有前景策略。未来研究糖基化、细胞因子信号和细胞代谢之间的相互作用可能为设计具有改善持久性和疗效的下一代CAR-T细胞疗法提供新机会，针对血液和实体恶性肿瘤。
