《International Journal of Molecular Sciences》：Hirudin as a Therapeutic and Brain-Delivery Platform: From Stroke to Central Nervous System Disorders
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穿越血脑屏障（BBB）仍然是中枢神经系统（CNS）治疗中的核心障碍。水蛭素是一种由65个氨基酸组成、由二硫键稳定的直接凝血酶抑制剂，在中医学中有着悠久的应用历史，其在血栓性疾病中表现出令人信服的疗效，并在临床前脑卒中模型中显示出越来越多的神经保护活性，且具备支
穿越血脑屏障（BBB）仍然是中枢神经系统（CNS）治疗中的核心障碍。水蛭素是一种由65个氨基酸组成、由二硫键稳定的直接凝血酶抑制剂，在中医学中有着悠久的应用历史，其在血栓性疾病中表现出令人信服的疗效，并在临床前脑卒中模型中显示出越来越多的神经保护活性，且具备支持性的临床信号。尽管很少有研究直接量化其BBB通透性，但现有证据表明，在病理条件下，脑部暴露量虽低但可测，这可能是通过细胞旁渗漏而非受体介导的转运实现的。为了拓展其在脑血管疾病中的治疗范围并降低出血风险，研究人员利用纳米载体包封、水凝胶递送系统、前药策略等方法对水蛭素进行了工程化改造，以增强靶向性、延长半衰期并实现局部激活。这些方法还实现了与现有中枢神经系统药物的协同组合，并可能促进联合治疗药物向脑部的递送。本综述总结了水蛭素在脑卒中、神经退行性疾病、精神疾病和脑肿瘤中的现有证据；评估了其依赖于具体病理情境的BBB渗透能力；并概述了以定量脑部药代动力学、病理引导的靶向、刺激响应型制剂、受控临床评估以及严格的出血风险和化学、制造和控制（CMC）准备度为中心的转化医学议程。
1. 引言
血脑屏障（BBB）通过严格调节血液与脑实质之间的物质交换来维持中枢神经系统（CNS）的稳态。它由紧密连接密封的特化内皮细胞形成，并由周细胞和星形胶质细胞终足支撑，同时受转运蛋白和代谢酶的强化。大多数分子量超出约400–600道尔顿（Da）或具有低亲脂性的小分子表现出较差的被动渗透性；因此，超过98%的小分子药物和几乎所有的生物制剂被排斥在脑组织之外。虽然增加亲脂性可以改善扩散，但这通常会增加脱靶毒性。因此，向脑部高效、安全地递送抗脑卒中、抗精神疾病和抗肿瘤药物仍然困难。
某些多肽凭借其结构和电荷特征，能够穿越或绕过BBB，在CNS疾病中显示出应用前景。水蛭素是一种由医用水蛭分泌的单链65氨基酸多肽，长期在传统中医学中用于促进循环和消散瘀血。其N端结构域介导强效的直接凝血酶抑制；亲水性的C末端有助于提升溶解度；半胱氨酸位点的三个二硫键（Cys6–Cys14, Cys16–Cys28, Cys32–Cys39）稳定了其折叠构象。除心脑血管疾病外，水蛭素及其类似物在癌症、糖尿病和皮肤疾病中也有研究。在脑卒中治疗中，BBB的破坏可能促进了水蛭素入脑，且多项研究表明其在脑缺血模型中具有神经保护作用，这引发了人们对水蛭素既作为治疗药物又作为辅助脑部递送的“分子载体”的兴趣。本综述综合了水蛭素在脑卒中领域的研究进展，探讨了其穿透BBB的证据与 presumed 机制，并评估了将水蛭素定位为多种CNS疾病脑部递送平台的工程化策略。
2. 水蛭素治疗脑卒中
脑卒中是全球死亡和致残的主要原因。约85%为缺血性脑卒中，由血栓栓塞或内皮功能障碍引起，打断脑血流并触发代谢衰竭、炎症和细胞死亡的级联反应。凝血酶是血栓形成和缺血再灌注损伤的核心效应因子：它将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，激活蛋白酶激活受体，并促进神经炎症、水肿和BBB功能障碍。脑缺血后凝血酶水平升高会激活小胶质细胞，导致神经元和星形胶质细胞损伤，加重继发性损害。
2.1. 水蛭素的抗凝机制与药理学优势
水蛭素是一种直接凝血酶抑制剂，具有介于0.1至0.3 pM的强亲和常数。它以1:1的化学计量比结合凝血酶，不依赖于抗凝血酶III，并能抑制游离的和与纤维蛋白结合的凝血酶。与肝素相比，水蛭素避免了肝素诱导的血小板减少症和血小板相互作用。与需要频繁监测国际标准化比值（INR）的维生素K拮抗剂华法林不同，水蛭素的直接、选择性凝血酶阻断产生了更可预测的抗凝效果。多种临床用药衍生自水蛭素药效团：来匹卢定和地西卢定是重组水蛭素变体，而比伐卢定是合成的基于水蛭素的肽。总体而言，这些药物在特定情况下补充或改进了肝素和华法林。
多项体内外研究支持水蛭素的抗血栓功效。水蛭素及其类似物在主要动脉和静脉血栓形成相关的疾病中均表现出获益。例如，载有水蛭素的仿生纳米颗粒在动脉粥样硬化模型中靶向血栓并改善了脂质代谢和炎症。在心肌缺血再灌注损伤和失血性休克/复苏中，水蛭素降低了心脏损伤生物标志物，抑制了巨噬细胞M1极化和细胞焦亡相关因子，并改善了左心室功能。在急性肺栓塞中，皮下注射重组水蛭素降低了肺动脉压和血管壁增厚。低分子量的RGD-水蛭素也在大鼠血栓模型中延长了凝血时间。
特别是在脑卒中治疗中，水蛭素表现出多模式作用，包括抗凝、抗炎、保护BBB和神经保护。在大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠中，水蛭素抑制了NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体组分。水蛭素还能减轻水肿、稳定BBB并抑制小胶质细胞激活和细胞因子释放。在蛛网膜下腔出血（SAH）中，水蛭素降低了脑含水量和促炎细胞因子水平，改善了神经功能缺损评分。在MCAO/R和氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型中，水蛭素增强了小胶质细胞活力并支持脑微血管内皮细胞存活、迁移和管形成，这与Wnt/β-catenin信号传导相关，从而在体内减少梗死体积。
2.2. 水蛭素治疗脑卒中的临床研究
重组组织纤溶酶原激活剂是急性缺血性脑卒中的标准溶栓药物，但受限于狭窄的时间窗、不完全的再通、出血转化和神经毒性。辅助性直接凝血酶抑制可能有助于预防微血栓形成和再闭塞，但需要仔细评估剂量和出血风险。指南建议对大脑静脉血栓进行抗凝治疗，通常先给予低分子肝素（LMWH），随后使用维生素K拮抗剂。鉴于其药理学特性，水蛭素在特定情况下是可行的替代方案。血管内治疗（EVT）已彻底改变了大血管闭塞的预后，围手术期使用水蛭素可能减轻手术相关的血栓形成并支持持续的再灌注。水蛭素类药物的临床试验表明其抗凝效果比肝素更可预测，但出血风险因剂量和情境而异。确定平衡疗效与颅内出血风险的最佳剂量仍然是重点。
3. 水蛭素穿透血脑屏障
3.1. 血脑屏障的结构
BBB代表了一个动态且高度受调节的界面，远超静态的解剖结构。它作为一个整合的神经血管单元（NVU）发挥作用，其中多种细胞类型的协调相互作用严格控制着血流和中枢神经系统之间的物质交换。NVU的核心解剖和功能元素包括：形成核心物理屏障并具有紧密连接的脑微血管内皮细胞；调节BBB特有基因表达模式并引导星形胶质细胞极化的周细胞；延伸“终足”包裹毛细血管以释放因子促进屏障表型的星形胶质细胞；以及由内皮细胞和星形胶质细胞共同分泌的基底膜。在缺血性脑卒中时，基底膜的溶解是BBB破坏的关键事件，这可能促进了水蛭素进入大脑。
3.2. 脑部暴露的证据
脑暴露的直接证据来自放射标记和定量质谱分析。健康小鼠静脉注射锝-99m标记的重组水蛭素（99mTc-rH）产生了低但可检测到的脑部放射性，ID%在5-120分钟内约为0.08–0.16，几乎表明对完整BBB的穿越有限。在兔颈动脉球囊损伤模型中，通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）检测到脑组织中存在ng/mL级别的水蛭素。此外，功能研究表明水蛭素给药后能稳定BBB并减少水肿和炎症，提示其实质内存在活性。这些数据表明水蛭素能以低水平到达脑部，并在BBB破坏条件下增加暴露量。
3.3. 水蛭素穿越BBB的假定机制
穿越BBB的多肽通常利用受体介导的胞吞作用或表现出细胞穿透特性。水蛭素是一种阴离子型、7 kDa的多肽，缺乏对BBB靶向受体的已知亲和力，也不表现出典型的细胞穿透肽特性。其理化特性不利于穿越完整内皮的被动渗透。然而，在病理状态下，炎症介质下调紧密连接蛋白并扩展细胞旁间隙。在这种情况下，大分子可以通过浓度梯度驱动的非特异性细胞旁渗漏进入。这一机制与健康动物中较低的脑部水乎相符，并与疾病模型中较高的功能效应相吻合。虽然不能完全排除胞吞作用，但目前数据最符合依赖于病理情境的细胞旁渗透途径。
3.4. BBB渗透的决定因素
3.4.1. CNS疾病中的BBB状态
BBB通透性在各种疾病中随时间变化很大。缺血再灌注、创伤、神经炎症等情况通过血管活性物质和细胞因子增加通透性。外部调节，如低强度脉冲超声联合微泡（LIPU–MB），可以瞬时且局部地打开BBB，增强药物向胶质母细胞瘤的递送。
3.4.2. 水蛭素的分子特性
与小分子的中等亲脂性CNS药物相比，水蛭素较高的分子量、亲水性和阴离子电荷限制了被动扩散，并可能导致快速的外周清除。与带负电荷的内皮表面的静电排斥进一步减少了相互作用，因此未修饰的水蛭素不太可能显著穿越完整的BBB。
3.4.3. 水蛭素的给药策略
给药途径影响脑部暴露。静脉给药避免了首过效应但仍受限于BBB；脑内给药绕过BBB但具侵入性。动脉内给药可提供更高的局部暴露；初步临床经验提示其在某些脑血管适应症中可行。鼻内给药利用嗅觉和三叉神经通路无创地绕过BBB，但重现性可能受黏膜纤毛清除和解剖变异影响。
3.4.4. 患者特异性变量
年龄、性激素、体力活动和合并症会调节BBB功能。例如，雄激素和炎症状态可以改变紧密连接蛋白和趋化因子，从而影响通透性。这种变异性强调了在涉及潜在CNS作用的抗凝药的临床试验中进行个体化给药和仔细监测的必要性。
4. 水蛭素针对脑血管疾病的脑靶向递送系统
水蛭素的高亲和力和特异性被其较短的半衰期和潜在的出血风险所抵消，导致较低的脑/血浆比。此外，免疫反应和多肽降解等临床挑战仍然是水蛭素等肽类药物面临的问题。现有的靶向递送形式多样，以下重点介绍纳米载体、水凝胶和前药策略。
4.1. 基于纳米载体的药物递送系统
纳米载体有潜力改善生物分布、药代动力学和脑部暴露。
4.1.1. 水蛭素的包封及稳定性和溶栓效力的增强
为了克服快速肾清除和蛋白水解降解，开发了基于纳米载体的递送系统来包封水蛭素，保护其免受酶促降解并延长半衰期。例如，载有水蛭素的牛血清白蛋白（BSA）纳米颗粒延长了抗血栓活性；iNanoAOX核壳复合物保护水蛭素并展现出溶栓潜力；阳离子脂质体增强了阴离子水蛭素的包封率。然而，简单的包封存在释放不精确和靶向性差的问题。通过血栓部位的血小板膜涂层等仿生表面修饰或功能化，可以增强水蛭素释放的时空控制，如HMPC@PM纳米平台在血栓部位特异性蓄积并抑制血栓复发。
4.1.2. 利用纳米载体平台共递送水蛭素和辅助药物
为了实现更综合的治疗结果，水蛭素与其他生物活性剂被共包封在多功能纳米载体中。这种结合抗凝和调节疾病微环境的综合治疗作用促成了更系统的治疗方案。例如，HMTL@PM纳米粒子共递送水蛭素和蚓激酶，有效抑制血栓形成并缓解炎症；血小板膜伪装的MnOx纳米花系统共递送水蛭素和Ag2S，协同治疗血栓和癌症。
4.2. 基于水凝胶的递送系统
水凝胶利用其固有的生物相容性和高度可调的释药特性，是水蛭素递送的有前景的载体。其亲水三维网络能实现水蛭素的有效包封和稳定控释。此外，水凝胶的可注射性便于微创给药，从而实现局部空间受限的持续性靶向治疗。将重组水蛭素掺入可注射的Pluronic F127水凝胶基质中，可实现持久的抗血栓功效并显著延长循环时间。
4.3. 前药策略
水蛭素的抗凝活性源于其N末端插入凝血酶活性位点。通过将掩蔽肽融合至前药，其活性在给药时可被抑制。前药循环稳定性增强，并在血栓相关酶的作用下被选择性裂解。例如，重组新水蛭素经FXa/FXIa裂解释放活性水蛭素（HV2）；通过结合人血清白蛋白和促凝血血小板，工程化的水蛭素前药在颈动脉损伤模型中展现出靶向蓄积优势并减少闭塞性血栓形成。
4.4. 其他递送系统
聚乙二醇化：涉及聚乙二醇的共价连接，增加流体动力学尺寸，减少蛋白水解和免疫原性，并延长循环时间。结合靶向配体的聚乙二醇化可进一步增强递送效率。
生物材料衍生的微球：使用小牛皮胶原作为载体的微球系统，在犬模型鞘内给药后能在脑脊液中维持有效药物浓度，显著减轻脑血管痉挛。
聚合物胶束：基于壳聚糖衍生物的聚离子复合胶束特异性结合血小板，延长水蛭素的全身保留并稳定其血浆浓度。
透皮微针贴片：使用PVP和PVA作为基质载有水蛭素的微针，可促进伤口愈合。3D打印的PLGA微针阵列展现了预防血栓形成的可行性。
微型机器人系统：将葡萄球菌激酶-水蛭素融合蛋白（SFH）包封于大肠杆菌外膜囊泡中，在体内外展现出强效溶栓活性且降低出血风险。
5. 水蛭素在其他脑部疾病中的治疗潜力拓展
由于其抗凝和抗炎作用，水蛭素在应对多因素CNS病理的合理联合用药中极具吸引力。通过适当的靶向和控制激活，水蛭素可被工程化为“治疗-载体”以调节脑部病理并协助递送其他药物。
5.1. 改良型水蛭素治疗脑卒中
仿生纳米载体可提高局部药物水平并最小化全身暴露，载有水蛭素的仿生纳米颗粒可通过整合BBB靶向配体改造用于脑血管疾病。延长rtPA半衰期的平台方法可与水蛭素共递送，将溶栓与持续的凝血酶抑制结合。支架涂层洗脱聚乙二醇化水蛭素已在动物模型中减少再狭窄，可能支持神经介入中的围手术期抗凝。
5.2. 水蛭素治疗神经退行性疾病
阿尔茨海默病（AD）：血管功能障碍导致AD发病，改善脑灌注可能有助于管理。一项先导研究表明水蛭素联合多奈哌齐改善认知。水蛭素可与Aβ/tau导向药物配对，提供血管和抗炎支持，并在BBB受损时作为递送载体辅助药物入脑。
帕金森病（PD）：PD以多巴胺能神经元丢失、α-突触核蛋白聚集为特征。抑制NLRP3信号可减少病理。装载水蛭素以抑制凝血酶/PAR驱动的炎症的靶向递送系统与抗突触核蛋白疗法共递送极具探索价值。但在早期PD完整的BBB情境下，需借助脑靶向配体或瞬时的BBB调节。
5.3. 水蛭素治疗精神疾病
纳米载体可以保护不稳定的药物，改善溶解度并增强脑部递送。水蛭素的作用可能是辅助性和工程化的，例如整合到靶向载体或利用疾病相关BBB变化的前药中。对于以突出神经炎症为特征的疾病，水蛭素的抗炎作用可能是相关的。然而，当水蛭素与增加出血风险的常用抗抑郁药如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂或三环类抗抑郁药联合使用时，必须严格评估出血风险。
5.4. 水蛭素治疗脑肿瘤
胶质瘤由于异质性的血脑肿瘤屏障（BBTB）带来严峻的给药挑战。聚乙二醇化联合受体介导的转运配体可增强BBB转运和抗肿瘤效能。水蛭素可作为联合治疗药物或多药有效载荷的一部分，有效抑制胶质瘤生长。考虑到脑肿瘤患者围手术期和疾病相关血栓发生率高，双重抗肿瘤和抗血栓策略具有临床吸引力。
6. 结论
总之，水蛭素已从天然抗凝药发展为CNS治疗候选药物，在脑卒中中具有依赖于具体情境的脑部渗透和神经保护活性。其到达脑部的能力在生理条件下有限，但在BBB破坏时增加，与细胞旁渗漏机制一致。这种特性结合其强效凝血酶抑制和抗炎作用，使水蛭素既是治疗药物又是脑部递送平台的潜在组成部分。未来的发展方向包括：设计能够响应疾病微环境并结合BBB靶向配体的刺激响应型载体；评估水蛭素与溶栓药、神经保护剂联合的多模式治疗；利用液相色谱-串联质谱平台建立脑暴露与药效的定量监测；在非人灵长类动物模型和脑类器官等转化模型中进行验证；探索在如肌萎缩侧索硬化等其他CNS疾病中的应用；以及尽早确证化学制造和控制（CMC）能力，以保证工程化水蛭素产品供应链的成熟度。通过关注定量药理学、精准靶向和可制造性，水蛭素平台有望为新一代CNS疗法做出重大贡献。
