综述：单细胞和单核转录组学在缺血性卒中研究中的分析方法与应用

《Biomolecules》：Analytical Methods and Application of Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomics in the Study of Ischemic Stroke

　　

背景：缺血性卒中仍然是全球死亡率和长期残疾的主要原因，具有复杂且异质性的病理生理过程。单细胞和单核RNA测序（sc/snRNA-seq）已被越来越多地应用于高分辨率研究细胞异质性。方法：研究人员系统检索了PubMed、Web of Science和Embase，以识别在缺血性卒中研究中应用sc/snRNA-seq的研究。基于检索到的文献，研究人员总结了这些研究中报道的生物信息学分析方法和应用策略，重点关注sc/snRNA-seq如何在不同研究背景下被利用。结果：sc/snRNA-seq在缺血性卒中中的应用已在物种和样本类型上迅速扩展。采用了广泛的后续生物信息学分析，包括聚类、差异表达分析、轨迹推断、基因调控网络分析和细胞间通讯分析。这些方法已被应用于研究缺血性卒中中的多种生物学过程。此外，这些分析策略已扩展到多种生物学背景，包括脑外组织、卒中相关修饰因子及其相关并发症。此外，结合多个数据集、批量转录组学和其他组学数据的整合分析方法已越来越多地被使用。时间和空间分辨率的进展使得跨越不同阶段和解剖区域的分析成为可能。结论：本综述系统总结了sc/snRNA-seq在缺血性卒中中的分析方法与应用策略。这些方法为理解单细胞技术在该领域的应用提供了一个结构化视角。未来的研究可能受益于标准化设计和协调的分析策略，以促进更系统的研究。

3. 单细胞RNA测序与单核RNA测序的比较：scRNA-seq分析完整细胞，捕获核和细胞质转录本，通常检测更多基因，但需要新鲜活细胞悬液，可能优先耗尽大或脆弱的神经细胞，并诱导体外应激或激活相关的转录变化，尤其在小胶质细胞和其他脑髓系细胞中。snRNA-seq可应用于冷冻、存档或难解离的脑组织，减少解离诱导的转录伪影，但核RNA仅代表全细胞转录组的一部分，且含有更高比例的内含子和新生转录本。两种方法可能回收不同的细胞群体，snRNA-seq可能低估某些免疫细胞。两者均不保留空间结构，但可通过提供细胞类型分辨参考谱来补充空间转录组学。因此，scRNA-seq和snRNA-seq应被视为互补而非可互换的方法，其选择取决于样本可用性、组织特征和生物学问题。

4. sc/snRNA-seq在缺血性卒中应用的发展：2018年首次应用scRNA-seq于卒中研究；2021年，Zheng等人和Guo等人分别独立发表了小鼠缺血/再灌注（I/R）模型缺血半球和梗死周围皮层的首个scRNA-seq图谱；同年，利用成年狨猴局灶性缺血生成了首个卒中snRNA-seq数据集。后续研究将方法扩展到人类样本，包括外周血、死后海马组织、卒中后皮层和血栓。Zheng等人的数据集已成为卒中领域被重分析最多的scRNA-seq数据集，作为二次分析和方法开发的基准。

5. 缺血性卒中中sc/snRNA-seq的分析框架与演变应用：
5.1. 数据预处理：包括细胞质量控制、归一化、批次效应校正、特征选择和降维。基于总UMI（Unique Molecular Identifier）计数、检测基因数和线粒体或核糖体转录本比例过滤细胞，使用SoupX、DecontX、CellBender和scCDC等工具最小化环境RNA污染。使用DoubletFinder和Scrublet进行双细胞检测与去除。基因表达常用Seurat对数归一化或SCTransform。批次校正和数据集整合使用Seurat的CCA（Canonical Correlation Analysis）整合、Harmony和scMerge。整合后选择高度可变基因进行PCA（Principal Component Analysis）降维。已发表的研究使用不同的预处理工具、过滤阈值和参数设置，同一公共数据集在原始和二次分析中也可能被不同处理，突显了卒中特异性预处理基准的缺乏。

5.2. 下游分析策略：
5.2.1. 细胞聚类与注释：下游分析通常从聚类和细胞类型注释开始。常用基于图的社区检测方法（Louvain和Leiden），以及经典标记基因或自动工具（SingleR、scmap、GPTCelltype）进行注释。在缺血性卒中中，这些分析为识别损伤相关小胶质细胞、浸润免疫细胞、神经血管群体等疾病特异性细胞状态建立细胞框架。聚类对预处理、特征选择、降维和分辨率参数敏感，可能合并或分裂动态的卒中后细胞状态，尤其对小胶质细胞和中性粒细胞亚群。

5.2.2. 细胞组成与差异丰度：差异丰度分析量化细胞群体在条件间的变化。传统方法如卡方检验，而scCODA等组成方法更适用于单细胞数据，Milo等邻域方法可检测连续或过渡状态。这些分析量化免疫细胞浸润、易感神经元丢失、反应性胶质细胞扩张和与组织修复相关的血管细胞变化。但推断的细胞比例反映相对组成，而非绝对数量，且不同工作流程（包括scRNA-seq与snRNA-seq）的细胞类型回收差异可能影响比较。

5.2.3. 差异基因表达：差异表达（DE）分析广泛用于识别条件间变化的基因和通路。细胞层面方法如Wilcoxon秩和检验常用于探索性分析，但可能低估样本间变异；伪批量方法（DESeq2、edgeR）在样本层面聚合计数，提供更稳健的推断；混合效应模型是替代方案。在缺血性卒中中，DE分析识别细胞类型特异性转录反应，如神经炎症、神经元损伤、血管生成和组织重塑。但DE结果受样本量、研究设计和模型假设影响，需在独立样本中验证。

5.2.4. 功能富集分析：使用基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和自定义特征进行功能富集，常见方法包括过表达分析（ORA）和基因集富集分析（GSEA）。这些分析确定卒中后不同细胞群体中优先激活的生物学过程，如炎症信号、氧化应激、铁死亡和血管重塑。但富集结果对分析选择敏感，且富集表示统计关联而非因果通路激活，需要生物学验证。

5.2.5. 基因集评分：与差异表达不同，基因集评分在单细胞水平评估生物学通路活性，允许比较衰老、铁死亡和糖酵解激活等过程在细胞群体间的差异。方法包括AddModuleScore、GSVA、ssGSEA、AUCell和UCell。评分受基因集定义、数据特征和算法选择影响，较高分数反映更强的转录特征，而非必然表示功能激活。

5.2.6. 代谢通路推断：代谢通路推断方法通过富集评分或代谢网络/通量建模（如scMetabolism、Compass、scFEA）在单细胞分辨率估计代谢活性或通量状态。在缺血性卒中中，这些方法用于研究免疫和血管细胞中的代谢重编程。但基于转录的代谢推断不直接测量酶活性或代谢物丰度，在缺血/再灌注中需谨慎解释。

5.2.7. 轨迹与细胞命运推断：轨迹推断方法（Monocle2/3、Slingshot）通过伪时间重建细胞连续状态变化。RNA velocity从剪接和未剪接转录本估计短期转录变化方向，CellRank整合RNA velocity与马尔可夫链推断初始和终末状态。CytoTRACE和scEntropy估计分化潜能和转录可塑性。在卒中中，轨迹推断帮助重建无法直接观察的激活和分化程序，如稳态到活化小胶质细胞的转变。但推断轨迹受算法假设、参数设置影响，伪时间代表计算排序而非真实时间。

5.2.8. 转录因子与基因调控网络：转录因子（TF）活性和基因调控程序可通过基于先验知识（DoRothEA）或数据驱动（SCENIC）方法推断。SCENIC通过TF-基因共表达和基序富集构建调控子。这些分析识别驱动疾病相关转录程序的上游调节因子，但提供间接计算推断，而非直接TF结合证据。

5.2.9. 细胞间通讯：细胞间通讯（CCC）分析通过配体-受体相互作用建模推断细胞间信号网络。工具包括CellChat、CellPhoneDB和NicheNet。在缺血性卒中中，CCC分析识别协调损伤和修复的信号通路。但CCC推断依赖于配体-受体数据库和算法，配体-受体共表达不确认功能信号或空间邻近，可能遗漏代谢物或神经递质介导的通讯。

5.2.10. 表型相关细胞与基因程序：表型相关分析框架（Scissor、hdWGCNA、cNMF、geneNMF）将单细胞转录特征与临床或实验表型关联。这些方法优先识别与卒中表型最相关的细胞群体和基因模块，但识别统计关联而非因果驱动因素，需在独立数据集中验证。

5.2.11. 计算机扰动：新兴框架（scTenifoldKnk、CellOracle）通过扰动基因调控网络预测基因扰动对细胞状态的影响。在卒中研究中，这些方法可优先候选基因进行实验验证，但预测受输入数据和推断网络限制。

5.3. sc/snRNA-seq生物信息学分析在缺血性卒中的应用：基于方法概述，本节总结下游分析在缺血性卒中中的应用。细胞类型分析：通过聚类和组成分析定义卒中后细胞景观，如MCAO后24小时识别17种主要细胞类型和多个亚群，单核细胞衍生细胞从约2%增至16%，内皮细胞相对增加。差异表达和功能富集：将细胞分辨转录变化与卒中机制关联，如卒中相关小胶质细胞亚群富集干扰素反应或细胞周期程序，Lrg1缺失后粘附相关基因在BBB相关细胞中改变。基因集评分：量化免疫激活、调节性细胞死亡（铁死亡、自噬、焦亡）、代谢程序和细胞衰老等特征。轨迹分析：重建小胶质细胞从稳态到激活状态的转变，以及中性粒细胞在老年缺血脑中的衰老相关特征。细胞间通讯：预测MCAO后以CCL、IL1、TNF、SPP1信号为中心的相互作用增加，老年小鼠中血管和髓鞘修复相关信号减弱。进一步下游特征：TF活性推断（如Rela活性升高）、表型相关分析（如Mrc1+巨噬细胞炎症模块）、计算机敲除预测（Ftl1、Fth1、CLEC4D扰动可能诱导免疫反应重编程）。治疗干预：分析表明Olig2 mRNA递送增加少突胶质细胞丰度，重复经颅磁刺激促进周细胞向血管平滑肌细胞转变，细胞通讯分析预测槲皮素负载细胞外囊泡增加神经元-少突胶质细胞通讯。

6. 缺血性卒中中的单细胞转录组学超越脑：单细胞转录组学已扩展到脑外组织，包括外周血、血栓、脑膜淋巴管、颅骨骨髓、脾、肠、血管（主动脉、动脉粥样硬化斑块）和心脏，揭示系统性免疫和炎症网络。在生物学修饰因子层面，被用于解析性别差异、昼夜节律、不同病因（如围手术期卒中）的影响。此外，扩展到卒中相关并发症（卒中后抑郁、认知障碍、癫痫）和其他神经组织（如视网膜缺血损伤）。

7. 单细胞转录组学的整合分析应用：整合分析策略包括：跨独立研究或公共数据集的scRNA-seq数据统一分析（如脑与外周血协调研究）；单细胞转录组数据与批量RNA测序数据结合；与表观基因组学（如ATAC-seq）、遗传流行病学方法（如孟德尔随机化）和其他多组学数据整合，例如通过SMR（Summary-data-based Mendelian Randomization）和共定位分析优先候选基因，并在scRNA-seq数据中验证表达。

8. sc/snRNA-seq的时空分辨率：时间分辨率通过策略性实验设计实现，在缺血性卒中急性、亚急性和慢性期多点采样，最长实验窗口从第2天至第21天。23项研究在多时间点应用sc/snRNA-seq，用于重建细胞和分子反应进展。空间分辨率通过空间转录组学（ST）平台（10× Visium、Slide-seq、Stereo-seq、MERFISH、Xenium）弥补，ST被用于定义梗死核心和半暗带，进行参考整合，揭示区域特异性细胞组成、基因表达模式和细胞间相互作用网络。近期研究将多时间点实验设计纳入ST，推进到真正的时空单细胞分析。

9. 讨论：sc/snRNA-seq技术为缺血性卒中研究提供了空前分辨率，从最初脑细胞图谱扩展到免疫反应、神经血管单元、BBB相关细胞转录变化、细胞死亡、代谢失调、衰老、神经再生、髓鞘再生及治疗干预等多方面。其应用已超越梗死核心和半暗带，涵盖脑外器官、共病条件和继发并发症。时间分辨率通过多时间点采样实现，空间分辨率通过ST整合弥补。未来方向包括：整合单细胞和单核数据集；问题驱动设计，聚焦临床相关问题（如无效再通、出血转化、复发性卒中）；采用多时间点、多组学、跨物种策略（包括非人灵长类模型）；功能性验证关键转录靶点和通路；扩展到临床研究，分析人类生物样本（血液、血栓、脑脊液、脑组织）。sc/snRNA-seq需超越描述性细胞图谱，解决因果机制，嵌入假设驱动框架，结合功能验证，将发现转化为靶向干预。

10. 结论：本综述系统总结了单细胞和单核转录组学在缺血性卒中研究中的应用策略和分析方法。这些应用涵盖脑组织病理、多器官和多背景因素、数据整合与多组学，以及时空分辨率进展。单细胞转录组学为缺血性卒中的研究提供了多层次分析框架，未来研究可能受益于标准化设计和协调的分析策略。