α-突触核蛋白PET放射性示踪剂M503-1619的结构-活性关系研究

《Molecules》：A Structure–Activity Relationship Study of Alpha Synuclein PET Radiotracer M503-1619

　　

先前的研究确定[¹¹C]M503-1619为正电子发射断层扫描(PET)放射性示踪剂开发的先导化合物。当前研究的目的是对M503-1619进行结构-活性关系(SAR)研究，以提高其对α-突触核蛋白(aSyn)的体外结合亲和力，并识别可能用氟-18标记的潜在放射性示踪剂。SAR研究的结果确定了在N-芳基哌嗪和苯甲酰胺部分引入氟的严格SAR。最有前景的化合物是M503-1619对应的2-氟乙基类似物。该化合物用氟-18进行放射性标记，随后在非人灵长类动物中进行体内PET成像研究，并进行体外放射自显影研究。在人类死后脑切片中的体外放射自显影研究表明，¹⁸F标记的放射性示踪剂与突触核蛋白病脑组织相比，对对照脑组织有更高的结合。该放射性示踪剂显示出高初始脑摄取和快速洗脱，这是PET放射性示踪剂对脑中低靶点密度的蛋白质如aSyn成像所需要的。然而，脑穿透性放射性标记代谢物的形成阻止了该化合物的进一步评估。从这项SAR研究中获得的见解指导了新型aSyn放射性配体的开发，避免形成不良的放射性标记代谢物。

**α-突触核蛋白PET放射性示踪剂M503-1619的结构-活性关系研究解读**

**研究背景与问题**
α-突触核蛋白（aSyn）的不溶性聚集体是突触核蛋白病（包括帕金森病（PD）、路易体痴呆（DLB）、帕金森病痴呆（PDD）以及多系统萎缩（MSA））的神经病理学标志。这些聚集体主要分为路易小体和路易神经突（见于PD、DLB、PDD）和胶质细胞包涵体（GCIs，见于MSA）。开发能够通过正电子发射断层扫描（PET）对aSyn聚集体进行体内成像的放射性示踪剂极具挑战性，主要障碍在于寻找能选择性结合aSyn聚集体而不结合β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的化合物，因为Aβ常作为共病理出现在PD、DLB和PDD中。尽管已有一些PET示踪剂（如[¹⁸F]ACI-12589、[¹⁸F]SPAL-T-06、[¹¹C]HY-2-15等）在MSA或PD患者中显示出一定潜力，但尚未有理想示踪剂能同时有效成像PD和MSA中的aSyn病理。研究人员此前通过超高通量计算机虚拟筛选，从4200万化合物库中确定了M503-1619，该化合物对aSyn具有高亲和力，对Aβ亲和力低，并用[¹¹C]标记后显示出良好的药代动力学特性。然而，为进一步提升aSyn亲和力和成像性能，并寻找可用氟-18标记的候选物，本研究对M503-1619进行了详细的结构-活性关系（SAR）研究。该研究发表在《Molecules》上。

**关键技术方法**
研究人员通过化学合成制备了一系列M503-1619类似物，重点在N-芳基哌嗪和苯甲酰胺部分引入氟或含氟基团。体外结合实验采用[³H]BF2846作为配体，在重组aSyn原纤维上测定亲和力，并用[³H]PiB在阿尔茨海默病（AD）脑组织匀浆中进行Aβ选择性筛选。放射合成通过[¹⁸F]2-氟乙基甲苯磺酸酯与酚前体GT-5-96的O-烷基化反应实现。体内PET成像在非人灵长类动物（NHP）上进行（恒河猴，来自宾夕法尼亚大学IACUC批准的方案）。体外放射自显影研究使用来自宾夕法尼亚大学神经退行性疾病研究中心（CNDR）的人类死后脑组织切片，包括PDD、DLB、MSA-帕金森型（MSA-P）和对照样本。

**研究结果**
**2.1. 化学合成**
研究人员合成了多种M503-1619类似物，包括在N-芳基哌嗪部分引入氟、第二芳香环或杂环，以及在苯甲酰胺部分引入氟、三氟甲基、2-氟乙氧基或3-氟-2-羟丙基等基团。通过核磁共振（NMR）和质谱确认结构。

**2.2. 体外结合实验**
- **N-芳基哌嗪部分的SAR**：M503-1619中的2-吡啶基最为关键，改为4-吡啶基（GT-9-38，Ki=142 nM）或3-吡啶基（GT-9-39，Ki>1000 nM）均显著降低亲和力。引入第二个氮原子（如2-嘧啶或2-吡嗪）导致亲和力中度下降（Ki分别为41.9 nM和13.5 nM）。在2-吡啶环上直接引入氟（GT-9-63、GT-9-64、GT-9-67、GT-9-68）导致aSyn结合完全丧失。添加第二个芳香环（如2-喹啉、异喹啉、2-喹喔啉）可提高亲和力，但增加计算log P至3.7-4.3。最有效的类似物是GT-5-84（Ki=1.6 nM）和GT-5-107（Ki=1.0 nM），两者对Aβ的Ki均>1000 nM。
- **苯甲酰胺部分的SAR**：直接在苯甲酰胺环上引入氟通常降低aSyn亲和力（如GT-9-36、GT-9-37）。将甲氧基替换为氟（GT-2-122）导致亲和力轻度下降。引入三氟甲基（GT-2-146、GT-2-149）大幅降低亲和力。将甲氧基转化为2-氟乙氧基（GT-2-114）后，aSyn亲和力保持与母体相当（Ki=4.9 nM），且Aβ结合不可测。引入3-氟-2-羟丙基（GT-2-123）则降低亲和力。

**2.3. [¹⁸F]GT-2-114的放射合成、NHP PET成像及死后人脑切片放射自显影**
- **放射合成**：[¹⁸F]GT-2-114通过两步法合成，产率19.8%（衰减校正），比活度130.94 GBq/μmol，放射化学纯度>99.5%。
- **NHP PET成像**：雄性NHP全脑峰值标准化摄取值（SUV）为1.82，雌性为2.29，峰值出现在1-3分钟。全脑峰值至60分钟SUV比为3.7（雄性）和3.9（雌性）。皮层下区域（丘脑、尾状核、壳核、小脑皮层、中脑、延髓）的洗脱速率略快于皮层区域。代谢物分析显示[¹⁸F]GT-2-114快速代谢，30分钟时母体分数仅18%，且代谢物比母体更极性。双组织室模型拟合不佳，全脑分布体积（VT）估计不稳定且随扫描时间增加而增加，提示存在脑穿透性放射性代谢物。
- **体外放射自显影**：在PDD、DLB、MSA-P和对照死后脑切片中，[¹⁸F]GT-2-114在突触核蛋白病脑组织中的结合高于对照，且路易体病（PDD和DLB）中的结合-病理比值高于MSA-P。

**讨论与结论**
讨论部分指出，SAR研究揭示了N-芳基哌嗪和苯甲酰胺部分引入氟的严格限制，GT-2-114是系列中最优化合物。尽管[¹⁸F]GT-2-114在NHP中显示出高脑摄取和快速洗脱，且体外放射自显影显示对aSyn病理的选择性结合，但脑穿透性放射性标记代谢物的形成使其无法作为候选示踪剂进一步推进。该SAR研究的见解正被用于设计新型aSyn放射性配体，以避免此类不良代谢物。

**结论翻译**：在M503-1619的SAR研究之后，确定了[¹⁸F]GT-2-114。该化合物GT-2-114表现出有前景的体外特性，包括对aSyn的高亲和力、对Aβ的低亲和力，以及能够用氟-18标记。氟-18标记的化合物[¹⁸F]GT-2-114在放射自显影研究中显示，与对照死后脑组织相比，在路易体中的aSyn病理中具有更高的结合。然而，体内药代动力学和代谢物NHP研究揭示了脑穿透性放射性标记代谢物的形成。这一局限性阻止了[¹⁸F]GT-2-114作为候选PET放射性配体的进一步评估和推进。本SAR研究的结果正被纳入新型aSyn放射性配体的设计中，以避免这种不良的放射性标记代谢物。